Podstawa, materiały, technika i zastosowania Wrighta



The Plama Wrigtha to technika kolorowania stworzona przez amerykańskiego patologa Jamesa Homera Wrighta w 1902 roku z plamy Romanowskiego. Ponieważ plama Romanowskiego była niestabilna, Wrigth włączył metanol jako rozpuszczalnik i utrwalacz.

To zabarwienie jest polichromatyczne, co oznacza, że ​​generuje kilka kolorów w zależności od struktury, którą absorbuje barwnik. Ta technika barwienia jest szeroko stosowana do wykonywania różnicowej liczby białych krwinek i badania morfologii krwinek czerwonych, płytek krwi i leukocytów we krwi obwodowej i szpiku kostnym..

Jego stosowanie jest bardzo ważne, ponieważ nieprawidłowości mogą być widoczne w różnych liniach komórkowych krwi, ułatwiając diagnozowanie chorób, takich jak białaczka lub zakażenia bakteryjne lub pasożytnicze.

Być może są to najpowszechniejsze zastosowania, w których ta technika jest używana, jednak nie są jedynymi. Jest również przydatny w próbkach innych niż krew i szpik kostny, takich jak między innymi próbki wydzieliny z nosa, śluzu kałowego, plwociny, skóry..

Indeks

  • 1 Podstawa plamy Wrighta
  • 2 Materiały
    • 2.1 Przygotowanie
    • 2.2 Buforowany roztwór buforowy
    • 2.3 Dodatkowe materiały potrzebne do wykonania zabarwienia
  • 3 Składniki plamy Wrighta
    • 3.1 Metanol
    • 3.2 Amortyzator
    • 3.3 Eozyna (Y)
    • 3.4 Błękit metylenowy
  • 4 Technika
  • 5 Narzędzie
    • 5.1 Hematologia
    • 5.2 Wydzielanie nosa
    • 5.3 Parazytologia
    • 5.4 Zakażenia układu oddechowego
    • 5.5 Bakteriologia
    • 5.6 Mykologia
  • 6 W jaki sposób obserwuje się struktury próbki krwi w plamie Wrighta??
  • 7 Zalecenia dotyczące dobrego barwienia
  • 8 Częste błędy w kolorowaniu Wrigth
    • 8.1 Bardzo blade zabarwienie
    • 8.2 Osady barwnika
    • 8.3 Rozmaz z bardzo czerwonawym lub niebieskim zabarwieniem
  • 9 Tryb pamięci
  • 10 referencji

Podstawa do plam Wrighta

Plama Wrighta zrodziła się z plamy Romanowsky'ego, która składa się z roztworu alkoholu metylowego z barwnika kwasowego (eozyna Y) i podstawowego (błękit metylenowy) i jego produktów utleniania.

Mieszanina barwników użyta w barwieniu Wrighta wywołuje efekt znany jako Romanowsky, to znaczy zapewnia piękne purpurowe zabarwienie jąder leukocytów i granulatów neutrofilowych, podczas gdy czerwone krwinki są zabarwione na różowo..

Komponenty odpowiedzialne za podanie zakresu kolorów typowego dla barwnika Wrighta to niebieski B i eozyna Y. Obserwowany efekt będzie zależał od wiązania barwników ze strukturami chemicznymi i oddziaływaniami niebieskiego B i eozyn Y.

Kwaśne struktury, takie jak kwasy nukleinowe, białka jądrowe i reaktywna niedojrzała cytoplazma niektórych typów komórek, utrwalają niebieski B (podstawowy barwnik).

Podczas gdy podstawowe struktury, takie jak hemoglobina, granulki segmentowanych eozynofili, wśród innych struktur komórkowych, utrwalają eozynę Y (barwnik kwasowy).

Na wynik barwienia mogą mieć wpływ różne czynniki, takie jak pH barwnika Wrighta, bufor i roztwór płuczący; jak również czas barwienia i utrwalania.

Dlatego każdy krok w przygotowaniu odczynników jest kluczowy i musi być wykonany z dbałością o każdy szczegół.

Materiały

Zabarwienie Wright. W przypadku 100 ml wymagane jest:

Odważyć 0,3 grama barwnika Wrighta, odmierzyć 97 ml metanolu i 3 ml glicerolu.

Przygotowanie

W moździerzu umieść ciężką ilość barwnika Wrighta i powoli dodawaj glicerol, aż proszek całkowicie się rozpuści..

Następnie dodaje się metanol, miesza i wlewa do bursztynowej butelki.

Przed użyciem roztwór należy potrząsać delikatnymi ruchami i filtrować.

Buforowany bufor

W litrze wody destylowanej 3,76 g wodorofosforanu disodowego (Na2HPO4   2H20) plus 2,1 g diwodorofosforanu potasu (KH)2PO4).

Wymieszać bardzo dobrze, aż wszystkie włączone odczynniki zostaną rozpuszczone. Ustaw pH na 7,2. Wlać do szklanego słoika i trzymać w temperaturze pokojowej.

Dodatkowe materiały potrzebne do wykonania zabarwienia

Dodatkowo, do przeprowadzenia techniki barwienia wymagane są inne materiały, są to: arkusze przenoszące przedmioty lub zakrywające przedmioty, mostek zabarwienia, pisety z wodą lub bufor do prania, stoper do mierzenia czasów barwienia i materiał suszący (papier chłonny, gaza lub bawełna).

Wright stain components

Metanol

Alkohol (metanol) służy jako utrwalacz rozmazu krwi na szkiełku.

Zasadniczo jest to odczynnik redukujący, odwadniacz i utrwalacz koagulantu. Dlatego jego funkcją jest koagulowanie białek i uczynienie ich nierozpuszczalnymi, ale bez ich denaturacji.

Metanol jest najczęściej stosowanym odczynnikiem do utrwalania rozmazów we wszystkich laboratoriach, ponieważ zapewnia lepsze wyniki niż te uzyskane przy użyciu etanolu. Idealna koncentracja wynosi 99%.

Amortyzator

Bufor (roztwór buforowany) ma funkcję regulowania lub utrzymywania pH barwnika, ponieważ pH dostosowane do 7,2 jest niezbędne dla prawidłowego wchłaniania barwników przez struktury komórkowe.

Z drugiej strony, przejście utrwalania metanolem odwadnia komórki, a bufor pomaga je uwodnić.

Eosin (Y)

Eozyna ma powinowactwo do podstawowych składników, ponieważ jest barwnikiem kwasowym. Dwa rodzaje eozyn są bardzo podobne do siebie, więc można użyć jednego z nich, uzyskując ten sam wynik.

Jedną z nich jest eozyna Y, żółta eozyna lub tetrabromofluoresceina i druga eozyna B, niebieskawa erytrozyna B lub dibromodinitrofluoresceina. Jednak eozyna Y jest najczęściej stosowana.

Najważniejszą właściwością tego barwnika jest jego ujemna polaryzacja, co powoduje, że jest przyciągany przez struktury komórkowe z ładunkiem dodatnim.

Błękit metylenowy

To podstawowa kolorystyka. Jego główną właściwością jest metachromazja, to znaczy nie wszystkie struktury będą barwione w tym samym kolorze, zależy to od składu chemicznego struktur, które barwi.

Niektóre z nich staną się jasne lub ciemnoniebieskie, a inne ciemnofioletowe lub blado liliowe.

Technika

1-Przeprowadzić rozprzestrzenianie się próbki, tak aby pozostała cienka folia na szkiełku lub szkiełku nakrywkowym.

2-Pozostawić do wyschnięcia na około 2 godziny.

3-Umieścić suchy rozmaz na mostku barwiącym lub na tacy do barwienia z próbką rozłożoną do góry.

4-Zakryj arkusz barwnikiem Wright kroplami, aż pokryje całą powierzchnię. Pozostaw na 5 - 8 minut.

5-Barwnik powinien całkowicie zakryć szkiełko, nie rozlewając się po krawędziach. Jeśli w czasie barwienia zacznie wyparowywać, należy umieścić dodatkowe krople.

6-Następnie dodaj równą ilość amortyzatora, dmuchnij trochę, aż pojawi się charakterystyczny metaliczny połysk. Od 10 do 15 minut.

7-Umyć wodą z kranu, umieszczając miękki strumień, aż arkusz będzie różowy.

8-Z gazy nasączonej alkoholem usuń barwnik przymocowany z tyłu szkiełka.

9 - Pozwól rozmazowi wyschnąć bardzo dobrze przed umieszczeniem oleju immersyjnego w celu wizualizacji w mikroskopie.

Narzędzie

Hematologia

Jest idealny do rozmazywania rozmazów krwi obwodowej, do badania rozmazów krwi i badania komórek z próbek szpiku kostnego.

Ze względu na właściwości chemiczne tej kombinacji barwników struktury komórkowe można łatwo rozpoznać, będąc w stanie odróżnić różne typy obecnych komórek.

Wydzielanie nosa

Ta technika jest bardzo przydatna do identyfikacji komórek wydzieliny nosowej (komórki nabłonkowe, segmentowane eozynofile, polimorfonuklearne) w diagnostyce alergicznego nieżytu nosa.

Parazytologia

W tym sensie był przydatny do badania Leishmania sp w histiocytach podskórnej tkanki komórkowej w owrzodzeniach skóry. Podobnie jest używany do identyfikacji leukocytów w próbkach stolca (leukogram kału).

W tym przypadku interesujące jest, aby lekarz wiedział, czy leukocytoza obecna w kale jest za pomocą wielojądrzastych lub jednojądrzastych. To stwierdzenie w leukogramie kału będzie wskazywać, czy jest to odpowiednio infekcja bakteryjna czy wirusowa.

Z drugiej strony, pasożyty krążące we krwi można znaleźć w erytrocytach lub w plazmie. Potrzebnymi pasożytami są Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii i filarias, aw medycynie weterynaryjnej jest przydatny w poszukiwaniu Theileria equi i Babesia caballi, czynniki sprawcze dzieci, zwłaszcza u koni.

Barwienie Wright i Giemsa może odróżniać hemoparazy od normalnych składników komórkowych. W tym celu możesz użyć dwóch rodzajów spreadów:

Drobne odcinki

Krew jest rozprowadzana jak cienki film na szkiełku. Barwiona barwnikiem Wrighta, ujawniająca cechy jądra i cytoplazmy.

Gruba kropla

Ta metodologia służy do badania obecności pasożytów w większej ilości krwi.

W tym celu dużą kroplę krwi umieszcza się na szkiełku. Gdy tam dotrzesz, powinieneś się rozwłóknić, wykonując coraz większe kółka od środka na zewnątrz, używając krawędzi innego slajdu.

W końcu, aby obserwować pasożyty w gęstej rozmazie, erytrocyty muszą zostać poddane lizie wodą.

Zakażenia układu oddechowego

Na poziomie oddechowym technika ta jest również przydatna, ponieważ komórki obecne w próbkach plwociny, popłuczynach oskrzelowych lub oskrzelowo-pęcherzykowych są ważne dla ustalenia diagnozy.

Podobnie można tu odróżnić komórki polimorfojądrowe i komórki jednojądrzaste.

Bakteriologia

Zastosowanie tej techniki w bakteriologii jest ograniczone, ponieważ nie jest dobre do barwienia bakterii, dlatego do ich barwienia stosuje się inne specjalistyczne techniki barwienia.

Został jednak wykorzystany do poszukiwania komórek nabłonkowych z ciałkami inkluzyjnymi Chlamydia trachomatis w rozmazach błony śluzowej cewki moczowej lub szyjki macicy, chociaż należy uznać, że nie jest to najlepsza metoda na to.

Możliwe jest również obserwowanie bakterii spiralnych wśród czerwonych krwinek Borrelia burgdorferi u zarażonych pacjentów, a także morulae lub ciałek inkluzyjnych Ehrlichia sp w cytoplazmie limfocytów, monocytów lub neutrofili w rozmazie krwi.

Mykologia

The Histoplasma capsulatum jest patogennym grzybem często diagnozowanym przez mikroskopową obserwację różnych próbek tkanek, barwionych barwnikiem Wrighta.

W jaki sposób obserwuje się struktury próbki krwi z barwnikiem Wrighta?

Zalecenia dotyczące dobrego barwienia

Przedłużanie próbek krwi powinno być samorzutnie suszone. Rozmazy powinny być tak cienkie, jak to możliwe, aby uzyskać lepsze utrwalenie barwnika i uniknąć nadmiernego nasycenia.

Do barwienia wysokiej jakości wskazane jest przeprowadzenie barwienia w ciągu dwóch godzin po przygotowaniu rozmazu. Z drugiej strony idealną próbką jest krew włośniczkowa bez antykoagulantu.

Jeśli jednak stosowana jest krew żylna, powinna być stosowana jako antykoagulant EDTA, a nie heparyna, ponieważ ta ostatnia może deformować struktury komórkowe.

Aby zapobiec zepsuciu przygotowanego barwnika, należy go przechowywać w suchych miejscach.

Podczas procesu mycia zaleca się stosowanie wody dostosowanej do neutralnego pH.

Wreszcie wskazane jest testowanie metod barwienia, które są używane w laboratorium co jakiś czas.

Odbywa się to poprzez barwienie próbek lub wydłużone wzory, jako kontrola jakości. Ten krok jest ważny, ponieważ zapewnia, że ​​barwienie jest odpowiednio przygotowane, a czasy barwienia są dobrze znormalizowane.

Jeśli arkusz wzoru jest źle zabarwiony, występują problemy, które należy rozwiązać.

Typowe błędy w kolorowaniu Wrigth

Bardzo blade zabarwienie

Bardzo blady rozmaz, zwykle z powodu bardzo krótkiego czasu barwienia lub bardzo przesadnego prania. Jest korygowany przez wydłużenie czasu kontaktu z barwnikiem lub przez zmniejszenie czasu prania.

Barwnik wytrąca się

Obecność wytrąconych barwników w rozmazie może mieć kilka przyczyn, jednak najczęstszymi przyczynami są: użycie niefiltrowanego barwnika, barwienie na nierównych mostkach barwiących, użycie brudnych arkuszy z kurzem lub tłuszczem, nie robienie dobrego prania w Zakończ barwienie.

Rozmaz z bardzo czerwonawym lub niebieskim zabarwieniem

Bufor odpowiada za pH barwnika. Barwniki o pH poniżej wskazanego (kwasu) będą powodować bardzo czerwone rozmazy.

Jeśli pH barwnika jest powyżej (zasadowe), uzyskuje się wyjątkowo niebieskawy rozmaz.

Tryb przechowywania

Odczynnik należy przechowywać w temperaturze pokojowej.

Referencje

  1. Gutiérrez V. Badanie porównawcze między metodą barwienia Wrighta a testem Elisa w diagnostyce Ehrlichiosis canina w mieście San Pedro Sula, Honduras. 2008. Praca dyplomowa ubiegająca się o tytuł lekarza weterynarii. Uniwersytet San Carlos de Gwatemala.
  2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Podstawowe barwienie w laboratorium mikrobiologicznym. Badania nad niepełnosprawnością. 2014; 3 (1): 10-18.
  3. „Plama Wrighta”. Wikipedia, darmowa encyklopedia. 18 maja 2018, 12:05 UTC. 8 grudnia 2018, 20:37
  4. Calderón A, Cardona J, Vergara -. Częstotliwość Babesia spp. u koni Montería, Córdoba (Kolumbia). Rev. udcaactual ujawnia.  2013; 16 (2): 451-458.
  5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Diagnostyka mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Argentyna Panamericana S.A Editorial.
  6. Retamales E, Mazo V. Instytut Zdrowia Publicznego Rząd Chile. Zalecenia dotyczące barwienia rozmazów krwi do odczytu liczby krwinek.