Stain by May Fundacja, technika i zastosowania Grünwald-Giemsa



The Niech plama Grünwald-Giemsa o Pappenheim to technika różnicowania barwników, która miesza odczynniki Giemsa i May Grünwald. Jest stosowany do różnicowania normalnych i nieprawidłowych krwinek w rozmazach krwi obwodowej i szpiku kostnego, a także do barwienia skrawków histologicznych i próbek cytologicznych.

Oba odczynniki - Gemsa i May Grünwald - pochodzą z barwienia typu Romanowsky'ego, techniki opartej na kombinacji barwników kwasowych i zasadowych.

Giemsa poprawiła technikę poprzez stabilizację mieszaniny eozyny, błękitu metylenowego i jego pochodnych, z gliceryną. Natomiast May Grünwald używa eozyny i błękitu metylenowego, stosując metanol jako rozpuszczalnik. Ta strategiczna kombinacja dała doskonałe wyniki.

Chociaż pod względem obserwacji morfologii komórek działa podobnie do zabarwień Giemsy i Wrighta, technika ta poprawia poprzednie, dopracowując zabarwienie pasożytów wywołujących malarię, chorobę Chagasa, leiszmaniozę i rzęsistkowicę.

Ponadto okazało się, że jest to bardzo przydatna technika do badania cytologicznego płynu nasiennego. Zostało ono podkreślone nie tylko poprzez pokazanie cech morfologicznych plemników, ale także pozwala na odróżnienie z dużą wydajnością leukocytów, komórek nabłonkowych i komórek spermatogenezy.

Indeks

  • 1 Fundacja
    • 1.1 Różnorodność barwników
  • 2 Technika
    • 2.1 Materiały
    • 2.2 Stężony roztwór barwnika May Grünwald
    • 2.3 Stężony barwnik Giemsa
    • 2.4 Przygotowanie roztworu buforowego o pH 7,2
    • 2.5 Rozmaz krwi lub procedura barwienia szpiku kostnego
    • 2.6 Rozszerzona technika barwienia płynu nasiennego
    • 2.7 Ważne specyfikacje
  • 3 zastosowania
    • 3.1 Cytologia pochwy
    • 3.2 Próbka nasienia
  • 4 odniesienia

Fundacja

Technika ta opiera się na podstawach plam Romanowskiego, w których barwniki kwasowe mają selektywne powinowactwo do podstawowych składników komórkowych, a składniki kwasowe przyciągają podstawowe barwniki.

Wyjaśnione w inny sposób, zarówno struktury komórkowe, jak i barwniki mają dodatnie lub ujemne ładunki elektryczne; równe ładunki odpychają i przyciągają różne ładunki.

Na przykład podstawowe barwniki, takie jak błękit metylenowy, są naładowane dodatnio i są przyciągane przez ujemnie naładowane struktury. Dlatego ten barwnik plami jądra, które są bogate w DNA i RNA, które mają ujemnie naładowane grupy fosforanowe.

Granulki segmentowanych bazofilów i cytoplazmy jednojądrzastych białych krwinek zawierających RNA są również barwione.

Podobnie, barwnik kwasowy niesie ładunek ujemny, dlatego łączy się z dodatnio naładowanymi strukturami, takimi jak erytrocyty i granulki segmentowanych eozynofili. Jeśli chodzi o granulki segmentowanych neutrofili, utrwalają one oba barwniki.

Różnorodność barwników

W tej technice współistnieje kombinacja reakcji między barwnikami ortochromatycznymi i metachromatycznymi. Ortochromatyka (eozyna i błękit metylenowy) wiążą się ze strukturą komórkową, z którą są powiązane i zapewniają stabilny kolor, który nie zmienia się.

Z drugiej strony, metachromatics (pochodne błękitu metylenowego lazur A i lazur B), zmieniają swój oryginalny kolor po związaniu z określoną strukturą, a może nawet być wiele odcieni.

Wreszcie, krok przeprowadzony przez rozwiązanie May Grünwald wymaga obecności wody, ponieważ bez niego barwnik przeniknie do struktur, ale nie zostanie naprawiony. Aby do tego doszło, barwnik musi stać się polarny lub zjonizowany, a zatem może wytrącać się i przyłączać do powiązanych struktur.

Technika

Materiały

- Slajdy do slajdów.

- Kolorowanki.

- Rozwiązanie May-Grünwald.

- Plama Giemsa.

- Woda destylowana.

Skoncentrowany roztwór barwnika May Grünwald

Musimy ważyć 0,25 g eozynowo-metylenowego błękitu (barwnik według May Grünwald) i rozpuścić w 100 ml metanolu. Mieszaninę następnie miesza się przez 1 godzinę i pozostawia na 24 godziny. Skończył czas, filtruje.

Aby zastosować tę technikę, barwnik May Grünwald należy rozcieńczyć w następujący sposób: dla 200 ml rozcieńczonego barwnika mierzy się 30 ml stężonego roztworu, dodaje się 20 ml roztworu buforowego i 150 ml wody destylowanej doprowadzonej do pH 7,2-7,3. , Następnie jest mieszany i filtrowany.

Skoncentrowany barwnik Giemsa

Odważyć 0,5 g błękitu azurozo-metylenowego (barwnik według Giemsy), rozpuścić w 50 ml metanolu i umieścić 50 ml gliceryny w mieszaninie.

Aby wykonać technikę, rozcieńczyć 1:10 roztworem buforowym i pozostawić na 10 minut. W razie potrzeby można go filtrować.

Przygotowanie roztworu buforowego o pH 7,2

Muszą być ważone:

- 40 mg dwuwodorofosforanu potasu (KH2PO4).

- 151 mg dwuwodnego wodorofosforanu sodu (Na2HPO4).

Oba związki rozpuszcza się w 100 ml wody.

Procedura rozmazu krwi lub barwienia szpiku kostnego

Istnieją dwie metody: klasyczna i szybka.

Tryb klasyczny

  1. Pokryć rozmazy przez 2 lub 3 minuty rozcieńczonym roztworem May-Grünwald.
  2. Umyć buforowaną wodą destylowaną, aby wyeliminować poprzednie rozwiązanie.
  3. Przykryj tym samym buforowanym roztworem do płukania i pozostaw na 1 minutę. Chodzi o to, że poprzedni barwnik jest przymocowany do struktur, a jednocześnie komórki są uwodnione.
  4. Dodaj 12 kropli rozcieńczonej nalewki Giemsa na zbuforowaną wodę i dmuchnij, aby wymieszać i homogenizować. Odstaw na 15 lub 20 minut.
  5. Umyj rozmazaną wodą destylowaną i umieść na powietrzu do wyschnięcia.
  6. Skup i obserwuj w mikroskopie optycznym komórki krwi wybarwione za pomocą obiektywu 40X. W razie potrzeby można użyć 100X.

Tryb szybki

  1. Przykryć rozmaz barwnikiem May Grünwald rozcieńczonym przez 1 minutę.
  2. Umyć zbuforowaną wodą destylowaną.
  3. Przykryj buforowaną wodą i odstaw na 1 minutę.
  4. Umieść rozcieńczony barwnik Giemsa i pozostaw na 5 minut.
  5. Umyć buforowaną wodą destylowaną i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.

Opisane tutaj techniki są przewodnikiem, ale należy wziąć pod uwagę, że procedury i czasy barwienia różnią się w zależności od domu handlowego, który dostarcza odczynniki. Wskazane jest, aby postępować zgodnie z krokami ściśle wskazanymi przez każdy dom handlowy.

Technika rozszerzania płynu plemnikowego

1- Przykryć pastę cienką warstwą roztworu May Grünwald przez 4 minuty.

2- Usunąć barwnik i umyć wodą destylowaną.

3- Umieścić warstwę rozcieńczonego Giemsa (1:10) w wodzie destylowanej przez 15 minut.

4- Usunąć barwnik i umyć wodą destylowaną.

5- Pozwól wyschnąć i obserwuj pod mikroskopem.

Ważne specyfikacje

Technika wymaga, aby odczynniki i roztwory do płukania miały pH ustawione na 7,2-7,3, tak aby powinowactwa barwników do struktur komórkowych nie zniekształcały się i nie zmieniały oczekiwanego ostatecznego koloru.

Używa

Technika ta jest stosowana przez laboratoria kliniczne do barwienia rozmazów krwi obwodowej i szpiku kostnego, skrawków tkanek i cytologii.

W dziedzinie hematologicznej technika ta ma zasadnicze znaczenie w badaniu nieprawidłowości komórek pod względem kształtu, wielkości i liczby. Jest to bardzo cenne narzędzie do diagnozowania niektórych chorób, takich jak białaczka i niedokrwistość.

Ponadto, stanowi wyjątkową użyteczność w poszukiwaniu pasożytów na polach hematologicznych (Plasmodium sp i Trypanosoma cruzi) lub histologiczne (Leishmanias sp).

Cytologia pochwy

Jeśli chodzi o cytologię pochwy, ta technika jest szczególnie korzystna do obserwacji Trichomonas vaginalis. Jest to ważne odkrycie, ponieważ jego obecność symuluje obrazy raka in situ które następnie znikają, gdy pasożyt zostaje wyeliminowany.

Próbka nasienia

Jest to idealne narzędzie do badania próbek nasienia, ponieważ dostarcza cennych informacji na temat jakości nasienia.

Oferowane przez niego dane muszą dotyczyć głównie liczby i morfologii, a także towarzyszących komórek, które mogą być obecne i które mają kluczowe znaczenie, takich jak komórki rozrodcze, leukocyty i komórki nabłonkowe.

Dzięki tej analizie możliwe jest opisanie nieprawidłowości obserwowanych w plemnikach w głowie, szyi, środkowej części i głównym elemencie.

Ponadto mogą również pomóc w pokazaniu przypadków hemospermii (obecność czerwonych krwinek w nasieniu) i leukospermii lub pirospermii (wzrost liczby leukocytów w nasieniu).

Referencje

  1. Costamagna S, Prado M. Walidacja testu świeżego, kolory May Grünwald-Giemsa i Gram i podłoża hodowlane do diagnozy Trichomonas vaginalis. Parasitol. 2001; 25 (1-2): 60-64. Dostępne w: scielo.
  2. Laboratorium Merck KGaA. Maj Grünwald eozyna błękit metylenowy do mikroskopii.
  3. „Plama Maj-Grünwald-Giemsa”. Wikipedia, darmowa encyklopedia. 15 listopada 2018, 14:37 UTC. 8 stycznia 2019, 04:29: en.wikipedia.org
  4. Laboratoryjne szkło chemiczne Panreac. Odczynniki do technik histologicznych, hematologicznych i mikrobiologicznych. Dostępne na stronie: glasschemicals.com
  5. Retamales E, Manzo V. Zalecenie dla barwienia rozmazów krwi do odczytu liczby krwinek. Krajowe i referencyjne laboratorium biomedyczne. Instytut Zdrowia Publicznego Chile.
  6. Sarabia L. Spermiogram według kryteriów WHO. Program anatomii i biologii rozwoju. Wydział Lekarski Uniwersytet Chile Dostępne pod adresem: pp.centramerica.com