Założenie, przygotowanie i zastosowanie TSI agaru



The Agar TSI lub potrójny agar z żelazem cukrowym jest stałą pożywką hodowlaną, która służy jako test biochemiczny prowadzący do początkowej identyfikacji pałeczek Gram ujemnych. Opiera się na potwierdzeniu fermentacji obecnych cukrów oraz produkcji siarkowodoru i gazu.

Jego skład i podłoże są bardzo podobne do testu żelaza Kliglera, z tą różnicą, że ta ostatnia zawiera tylko glukozę i laktozę. Zamiast tego, jak sama nazwa wskazuje, żelazo potrójne zawiera trzy ulegające fermentacji węglowodany: glukozę, laktozę i sacharozę..

Ponadto podłoże TSI ma cztery pochodne białkowe, które czynią go bardzo odżywczym agarem: ekstraktem drożdżowym, ekstraktem mięsnym, peptonem i peptonem proteozowym. Zawiera również siarczan amonu żelazawego, tiosiarczan sodu, chlorek sodu, czerwień fenolową i agar.

Niezdolność mikroorganizmu do fermentacji glukozy obecnej w pożywce natychmiast wyklucza go z przynależności do rodziny Enterobacteriaceae. Dlatego też test ten jest niezbędny, aby zdecydować, którą drogę identyfikacji należy podjąć, aby określić rodzaj i gatunek.

Każde laboratorium decyduje, czy współpracuje z agarem TSI, czy agarem agarowym Kligler.

Indeks

  • 1 Fundacja
    • 1.1 Chlorek sodu i agar
    • 1.2 wskaźnik pH (czerwień fenolowa)
    • 1.3 Pochodne białek (ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny, pepton i pepton proteozy)
    • 1.4 Fermentacja węglowodanów (glukoza, laktoza i sacharoza)
    • 1.5 Produkcja gazu
    • 1.6 Tiosiarczan sodu i żelazowy siarczan amonu (produkcja siarkowodoru)
  • 2 Przygotowanie
  • 3 zastosowania
  • 4 Nasiona
  • 5 Ograniczenia
  • 6 referencji

Fundacja

Każdy ze związków spełnia funkcję w ośrodku.

Chlorek sodu i agar

Chlorek sodu jest niezbędny do utrzymania równowagi osmotycznej pożywki. Podczas gdy agar daje stałą konsystencję.

Wskaźnik PH (czerwień fenolowa)

PH przygotowanego podłoża jest zrównoważone do 7,3, a wskaźnik pH (czerwień fenolowa) zmienia kolor na żółty poniżej 6,8. Oznacza to, że małe ilości kwasu wytwarzanego przez fermentację cukrów zmienią medium z czerwono-pomarańczowego na żółte.

Jeśli fermentacja nie wystąpi, nastąpi alkalizacja podłoża za pomocą peptonów, zmieniając kolor z czerwono-pomarańczowego na mocny czerwony.

Pochodne białek (ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny, pepton i pepton proteozy)

Gdy bakterie metabolizują białka obecne w agarze TSI, wytwarzane są aminy, które alkalizują podłoże (głównie na poziomie skosu), ponieważ reakcja wymaga tlenu. Aminy zmieniają ramkę w mocną czerwień.

Ale to zależy od zdolności bakterii do fermentacji węglowodanów, czy nie.

Fermentacja węglowodanów (glukoza, laktoza i sacharoza)

Badanie fermentacji cukrów może dać kilka obrazów i każdy z nich jest różnie interpretowany. Interpretacja testu dzieli mikroorganizmy na 3 kategorie: fermentory bez glukozy, fermentory bez laktozy i fermentory z laktozą / sacharozą.

Należy zauważyć, że ilość glukozy w pożywce jest ograniczona, podczas gdy stężenie laktozy i sacharozy jest 10 razy wyższe.

Bakterie z rodziny Enterobacteriaceae i inne mikroorganizmy fermentujące glukozę zaczną fermentować ten cukier, ponieważ jest to najprostszy węglowodan energii..

Z drugiej strony laktoza i sacharoza są złożonymi węglowodanami, które muszą zostać rozbite i przekształcone w glukozę, aby mogły wejść w cykl Embden-Meyerhof.

-Niefermentujące mikroorganizmy glukozy

Gdy zaszczepiony mikroorganizm nie jest w stanie fermentować glukozy, znacznie mniej może fermentować inne węglowodany. Dlatego nie powstają tu kwasy, ale powstaje amina w skosie dzięki zastosowaniu peptonów.

W tym przypadku skos zamienia się w mocniejszą czerwień, a spód rurki może pozostać niezmieniony lub też może zostać zalkalizowany, pozostawiając całą czerwoną rurkę.

Interpretacja: K / K oznacza alkaliczne fazowanie / alkaliczne lub neutralne tło

Na obrazku, który znajduje się na początku artykułu, zobacz obraz rury D.

Wynik ten wskazuje, że mikroorganizm nie należy do rodziny Enterobacteriaceae.

-Niefermentujące mikroorganizmy laktozy / sacharozy

Jeśli bakterie są zdolne do fermentacji glukozy, ale nie laktozy lub sacharozy, dojdzie do następujących zdarzeń:

Bakteria zużyje całą obecną glukozę po około 6 do 8 godzinach, będąc w stanie zakwaszać zarówno fazę jak i taco; to znaczy, agar będzie całkowicie żółty. Ale gdy poziom glukozy zostanie wyczerpany, a niemożność użycia laktozy i sacharozy, bakterie rozpoczną metabolizm białek.

Ta reakcja wymaga tlenu, dlatego degradacja peptonów zachodzi na powierzchni (skos). Wytworzone aminy alkalizują ramkę, zmieniając kolor żółty na czerwony. Reakcję tę potwierdza się po 18 do 24 godzinach inkubacji.

Interpretacja: K / A oznacza alkaliczne fazowanie i kwaśne taco.

Na obrazku, który znajduje się na początku artykułu, zobacz obraz tubki B..

-Mikroorganizmy fermentujące laktozę / sacharozę

Oczywiście, mikroorganizmy zdolne do fermentacji laktozy i sacharozy mogą fermentować glukozę. Po wyczerpaniu minimalnej ilości glukozy obecnej w pożywce, powstały pirogronian zaczyna metabolizować, tworząc kwasy w cyklu tlenowym Krebsa, aw okresie od 8 do 12 godzin całe podłoże będzie żółte.

Jeśli bakterie są w stanie rozszczepić laktozę lub sacharozę, nadal będą wytwarzane kwasy, a po 18 do 24 godzinach cała probówka - dziób i taco - pozostanie żółta.

Należy zauważyć, że stosowanie glukozy odbywa się na dwa sposoby: jeden w formie tlenowej w skosie probówki, a drugi beztlenowo w dolnej części probówki.

Interpretacja: A / A oznacza kwaśny skos / dno kwasu. Może prezentować gaz, czy nie.

Na obrazku, który jest na początku artykułu, zobacz obraz tubki A.

Produkcja gazu

Niektóre mikroorganizmy są zdolne do wytwarzania gazu podczas fermentacji cukrów. Gaz jest widoczny w rurze pod wpływem ciśnienia, które wywiera wewnątrz agaru. Ciśnienie powoduje powstawanie pęcherzyków lub przemieszczenie agaru. Czasami powstawanie gazu może spowodować pęknięcie medium.

Ważne jest, aby w czasie zaszczepiania pożywki TSI nakłucie było wykonywane czysto przez środek agaru, aż osiągnie dno. Jeśli przebicie zostanie skierowane w kierunku ścian rury, może spowodować fałszywe alarmy w produkcji gazu, ponieważ ucieknie przez nieprawidłowo uformowany kanał.

Wytwarzanie gazu, jak również reakcje zachodzące w skosie agarowym, wymagają tlenu, dlatego zaleca się, aby rura była pokryta bawełnianą zatyczką, a jeśli stosuje się pokrywkę bakelitową, nie należy jej całkowicie regulować.

Produkcja gazu jest zgłaszana jako dodatnia (+) lub ujemna (-).

Tiosiarczan sodu i żelazowy siarczan amonu (produkcja siarkowodoru)

Bakterie zdolne do wytwarzania siarkowodoru (bezbarwny gaz), przyjmują siarkę tiosiarczanu sodu obecnego w ośrodku. Po utworzeniu H2S reaguje z siarczanem żelaza amonowym, wytwarzając siarczek żelaza (wyraźnie widoczny czarny osad).

Produkcja H2S jest zgłaszane jako dodatnie (+) lub ujemne (-).

Na obrazku, który jest na początku artykułu, zobacz obraz tubki C.

Przygotowanie

Odważyć 62,5 g odwodnionego agaru z potrójnym cukrem cukrowym (TSI) i rozpuścić w jednym litrze wody destylowanej.

Ogrzewać aż do całkowitego rozpuszczenia agaru. Gotować przez minutę, często mieszając. Rozprowadzić 4 ml podłoża w probówkach 13/100 z bawełnianą pokrywką.

Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 ° C przez 15 minut. Wyjmij z autoklawu i pozwól odpocząć w pochyły sposób. Należy uważać, aby zarówno podstawa, jak i ramka miały tę samą odległość.

Przechowywać w lodówce 2-8 ° C Pozwól się uspokoić przed posadzeniem szczepu bakteryjnego.

Barwa odwodnionego podłoża jest jasnobeżowa, a przygotowana pożywka jest czerwono-pomarańczowa

Końcowe pH przygotowanego podłoża wynosi 7,3 ± 0,2.

Używa

Test TSI jest szeroko stosowany na poziomie laboratorium mikrobiologicznego. Ten test ma zasadnicze znaczenie dla wskazania rodzaju testu, który należy zastosować, aby uzyskać identyfikację rodzaju i gatunku. Jego dobre wykonanie i interpretacja mogą uratować materiał i pracę.

Jeśli wynik jest TSI K / K, a test oksydazy cytochromowej jest pozytywny, wiadomo, że testy powinny być stosowane do identyfikacji niefermentujących Gram-ujemnych pałeczek, takich jak Pseudomonas, Alcaligen, Achromobacter, Burkholderia, wśród innych rodzajów. Jeśli jest to oksydaza ujemna, jest zorientowana na rodzaje Acinetobacter, Stenotrophomonas itp..

Z drugiej strony, jeśli uzyskuje się TSI A / A lub K / A, a test oksydazy cytochromowej jest negatywny, im więcej azotanów zostanie zredukowanych do azotynów, będziemy mieć pewność, że jest to mikroorganizm należący do rodziny Enterobacteriaceae. W tym przypadku trasa identyfikacji będzie ukierunkowana na specyficzne testy dla tej grupy bakterii.

Z drugiej strony, jeśli uzyskany zostanie obraz K / A lub A / A, a test oksydazy cytochromowej jest pozytywny, dodatkowe testy, które zostaną zamontowane, będą ukierunkowane na identyfikację szczepów fermentujących, które nie należą do rodziny Enterobacteriaceae, takich jak: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio i Pasteurella.

TSI z siarkowodorem, ujemną oksydazą, poprowadzi identyfikację następujących rodzajów rodziny Enterobacteriaceae: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella lub Salmonella.

TSI ze skąpym lub umiarkowanym siarkowodorem w skosie alkalicznym z dnem alkalicznym i oksydazą dodatnią poprowadzi stosowanie testów do identyfikacji Gram-ujemnych, niefermentujących pałeczek wytwarzających H2S, takie jak Shewanella putrefaciens.

Wreszcie, TSI może być wykorzystana do badania produkcji siarkowodoru w Gram-dodatnich pałeczkach, zwłaszcza gdy podejrzewa się Erysipelothrix rhusiopathiae.

Zasiane

Pożywkę TSI należy zaszczepić czystymi koloniami, wyizolowanymi w kulturach pierwotnych lub selektywnych. Jeśli kolonia jest pobierana z pożywek selekcyjnych wysianych próbkami z mieszaną florą, należy zachować ostrożność, aby wziąć tylko powierzchnię, ponieważ w dolnej części kolonii mogą znajdować się żywe szczepy zahamowane w tej pożywce.

Dlatego pętli nigdy nie należy chłodzić w selektywnym podłożu, aby następnie pobrać kolonię i zaszczepić podłoże TSI.

Sadzenie będzie wykonane za pomocą prostej pętli lub igły. Wykonane zostanie nakłucie, uważając, aby przebiegało przez środek środka, aż do osiągnięcia dna, a następnie sadzenie zakończy się zaszczepieniem powierzchni w zygzakowaty sposób. Nie rób dwóch przebić.

Inkubować w 37 ° C w aerobiosie przez 18-24 godzin. Interpretuj w tym czasie, ani przed ani po.

Ograniczenia

Test TSI powinien być odczytywany od 18 do 24 godzin inkubacji. Odczyt przed tym czasem może dać fałszywie dodatni wynik fermentacji A / A. Natomiast odczyt po tym czasie może prowadzić do fałszywego negatywnego obrazu niefermentora, ze względu na zużycie peptonów, które alkalizują podłoże.

Referencje

  1. Mac Faddin J. (2003). Testy biochemiczne do identyfikacji bakterii o znaczeniu klinicznym. 3rd ed. Od redakcji Panamericana. Buenos Aires Argentyna.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostyka mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana S.A. Argentyna.
  3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnostyka mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana S.A. Argentyna.
  4. „Agar TSI”. Wikipedia, darmowa encyklopedia. 10 lip 2018, 08:09 UTC. 10 lutego 2019, 03:33 Dostępne na: en.wikipedia.org
  5. Laboratories Britania. TSI Agar (potrójny agar z żelazem). 2015. Dostępny na: britanialab.com
  6. Laboratoria BD Potrójny agar z żelazem (TSI Agar). 2003. Dostępny na: bd.com