Agar Sabouraud fundament, przygotowanie i zastosowania



The Agar Sabourauda, Znany również jako agar dekstrozowy Sabourauda, ​​jest to stała pożywka hodowlana, szczególnie wzbogacona do izolacji i rozwoju grzybów, takich jak drożdże, pleśnie i dermatofity..

Oznacza to, że nie może zabraknąć laboratorium mikrobiologicznego do badania obecności patogennych lub oportunistycznych grzybów, zarówno z próbek klinicznych, jak i nieklinicznych. Podobnie jest również idealny do wzrostu bakterii nitkowatych, takich jak Streptomyces i Nocardia. Jego stosowanie jest bardzo szerokie, może być stosowane w mikologii ludzkiej, zwierzęcej, roślinnej i przemysłowej.

To medium zostało stworzone w 1896 roku przez znanego dermatologa Raimonda Sabourauda, ​​który stał się światowej sławy specjalistą w dziedzinie zaburzeń skóry głowy, spowodowanym głównie przez dermatofity..

Jego stworzenie było tak ważne, że od tego czasu było używane i trwa do dziś, choć z pewnymi modyfikacjami.

Chociaż jest to szczególne dla grzybów, w tej pożywce bakterie mogą rosnąć, dlatego dla próbek z mieszaną florą wymaga włączenia antybiotyków do ich przygotowania, a tym samym hamowania wzrostu flory bakteryjnej, która może być obecna.

Wyboru antybiotyku należy dokonywać ostrożnie i biorąc pod uwagę rodzaj grzyba, który chcesz odzyskać, ponieważ niektóre są hamowane w obecności pewnych substancji.

Indeks

  • 1 Fundacja
    • 1.1 Najczęściej stosowane kombinacje agaru dekstrozowego Sabouraud z antybiotykami
  • 2 Przygotowanie
    • 2.1 Dekstroza Sabouraud Agar 
    • 2.2 Sabouraud Dextrose Agar (modyfikacja Emmons)
    • 2.3 Agar dekstrozowy Sabourauda (modyfikacja Emmons) z chloramfenikolem
    • 2.4. Dekstroza Sabouraud Emmons agar z cykloheksymidem
    • 2.5 Dekstroza Sabouraud Agar (Emmons) z chloramfenikolem i cykloheksymidem
    • 2.6 Inne antybiotyki, które można dodać
  • 3 Uwagi specjalne
  • 4 Kontrola jakości
  • 5 zastosowań
    • 5.1 Uprawa pierwotna
    • 5.2 Sporulacja
    • 5.3 Konserwacja
    • 5.4 Mikrokultury
    • 5.5 W mikologii człowieka
    • 5.6 Mikologia zwierzęca
    • 5.7 Mikologia środowiskowa
    • 5.8 Mikologia przemysłowa
    • 5.9 Mikologia roślin
  • 6 referencji

Fundacja

Agar dekstrozowy Sabourauda jest podłożem, które w swojej pierwotnej formule jest słabo selektywne, ze względu na kwaśne pH 5,6 ± 0,2, jednak bakterie mogą się nadal rozwijać, głównie w długotrwałych inkubacjach.

Pożywka zawiera pepton kazeinowy i strawioną trzustkę tkankę zwierzęcą, które stanowią źródło węgla i azotu dla rozwoju mikroorganizmów.

Zawiera również wysokie stężenie glukozy, która działa jako źródło energii, sprzyjając rozwojowi grzybów nad bakteriami. Całość wymieszana z agarem agarowym, składnikiem zapewniającym odpowiednią konsystencję.

Z drugiej strony, agar dekstrozowy Sabourauda może być selektywny, jeśli dodawane są antybiotyki.

W przypadku antybiotyków jest on szczególnie przydatny w próbkach ran, otwartych wrzodach lub dowolnej próbce, w której podejrzewa się duże zanieczyszczenie bakteryjne.

Najczęściej stosowane kombinacje agaru dekstrozowego Sabouraud z antybiotykami

-Agar Sabourauda z chloramfenikolem: idealny do odzyskiwania drożdży i grzybów nitkowatych.

-Sabouraud agar z gentamycyną i chloramfenikolem: w tej pożywce rosną prawie wszystkie grzyby nitkowate i drożdże oraz hamują dużą liczbę bakterii, w tym Enterobacteria, Pseudomonas i Staphylococcus.

-Agar Sabourauda z cykloheksymidem: jest szczególnie przydatny w przypadku próbek ze skóry lub dróg oddechowych, o ile podejrzenie dotyczy grzybów dimorficznych.

Cykloheksymid należy stosować ostrożnie; Chociaż stosuje się go do hamowania wzrostu niepatogennych lub środowiskowych grzybów i drożdży, które mogą występować jako zanieczyszczenia w próbce, hamuje również wzrost niektórych grzybów, takich jak Cryptococcus neoformans,  Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp inne oportunistyczne grzyby.

-Agar Sabourauda z chloramfenikolem i cykloheksymidem: jest używany głównie do izolacji dimorficznych dermatofitów i grzybów. Wadą jest to, że hamuje niektóre gatunki oportunistycznych grzybów Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes lub C. neoformans.

-Agar Sabourauda z chloramfenikolem, streptomycyną, penicyliną G i cykloheksymidem: jest idealny do próbek bardzo zanieczyszczonych bakteriami i grzybami saprofitycznymi, ale ma tę wadę, że hamuje wzrost Actinomyces i Nocardias, oprócz oportunistycznych grzybów wymienionych powyżej.

Przygotowanie

Jeśli masz składniki osobno, możesz je przygotować w następujący sposób:

Agar z dekstrozą Sabouraud 

Zważ:

- 40 g dekstrozy

- 10 g peptonu

- 15 g agaru

- Zmierz 1000 ml wody destylowanej

Wszystkie składniki miesza się, pH doprowadza się do 5,6. Rozpuścić substancje rozpuszczone przez gotowanie, rozprowadzić 20 ml medium w probówkach o wymiarach 25 x 150 mm, bez kołnierza i z bawełnianym daszkiem, najlepiej.

Można również stosować inne rozmiary tub, w zależności od dostępności.

Są autoklawowane przez 10 minut w atmosferze ciśnienia (121 ° C). Nie przekraczaj czasu autoklawowania. Po wyjściu z autoklawu probówki przechyla się za pomocą podpory, aż zestalą się w piku fletu..

Innym sposobem jest rozpuszczenie składników przez ogrzewanie, aż się zagotuje. W tej samej fiolce autoklawu przez 10 minut, a następnie rozprowadzić 20 ml na szalkach Petriego.

Jeśli dostępne jest podłoże z agarem dekstrozowym Sabouraud, które zawiera już wszystkie składniki, przystępujemy do ważenia ilości określonej przez dom handlowy na jeden litr wody. Pozostałe kroki są takie same jak opisane powyżej.

Agar dekstrozowy Sabouraud (modyfikacja Emmons)

Zważ:

-  20 g dekstrozy

- 10 g peptonu

-  17 g agaru

-  Zmierz 1000 ml wody destylowanej

Wszystkie składniki miesza się, pH doprowadza się do 6,9. Postępuj w taki sam sposób jak w poprzednim przypadku.

Istnieją domy komercyjne oferujące średnie ze wszystkimi składnikami. W takim przypadku należy zważyć i przygotować zgodnie z opisem we wkładce.

Sabouraud dekstrozowy agar (modyfikacja Emmons) z chloramfenikolem

Roztwór podstawowy chloramfenikolu

- Odważyć 500 mg zasady chloramfenikolu

- Zmierzyć 100 ml 95% etanolu

- Wymieszać

Podłoże agarowe z dekstrozą Sabourauda (Emmons) przygotowuje się w sposób opisany powyżej i dodatkowo na każdy litr pożywki dodaje 10 ml roztworu podstawowego chloramfenikolu przed autoklawowaniem..

Agar dekstrozowy Sabouraud Emmons z cykloheksymidem

Roztwór podstawowy cykloheksymidu

- Odważ 5 g cykloheksymidu

- Zmierzyć 100 ml acetonu

- Wymieszać

Podłoże agarowe z dekstrozą Sabourauda (Emmons) przygotowuje się jak już opisano i dodatkowo na każdy litr pożywki dodaje 10 ml roztworu podstawowego cykloheksymidu przed autoklawowaniem.

Sabouraud agar dekstrozowy (Emmons) z chloramfenikolem i cykloheksymidem

Podłoże agarowe z dekstrozą Sabourauda (Emmons) przygotowuje się w sposób opisany powyżej i dodatkowo na każdy litr pożywki dodaje 10 ml roztworu podstawowego chloramfenikolu i 10 ml roztworu podstawowego cykloheksymidu przed autoklawowaniem.

Inne antybiotyki, które można dodać

20 000 do 60 000 jednostek penicyliny na litr medium.

30 mg streptomycyny na litr pożywki.

Oba należy włączyć po autoklawowaniu medium, lekko schłodzonego (50-55 ° C).

0,04 g neomycyny na litr pożywki.

0,04 g gentamycyny na litr pożywki.

Szczególne uwagi

Dla bezpieczeństwa preferuje się sadzenie agaru dekstrozowego Sabourauda w rurkach o kształcie klina (nachylonych pod kątem piku) zamiast na szalkach Petriego, aby uniknąć dyspersji i wdychania zarodników..

Ważne jest, aby probówki z agarem Sabourauda były pokryte bawełną, a nie zakrętką, ponieważ wykazano, że warunki półcienne powodują powstawanie zarodników w niektórych szczepach, na przykład Coccidioides immitis. Ponadto większość grzybów jest tlenowa.

Jeśli używasz zakrętki, nie zamykaj szczelnie.

Kontrola jakości

Przygotowane media muszą mieć kontrolę jakości, aby zweryfikować ich prawidłowe funkcjonowanie. W tym celu wysiewa się pewne szczepy kontrolne.

W przypadku agaru dekstrozowego Sabouraud z chloramfenikolem można stosować szczepy ATCC. Candida albicans, który musi mieć doskonały wzrost. Inną płytkę zaszczepia się szczepami Escherichia coli, musi być całkowicie zahamowany.

Inkubuje się niezaszczepioną płytkę, w której nie powinien rosnąć żaden mikroorganizm.

Sabouraud agar dekstrozowy z chloramfenikolem i cykloheksymidem można stosować jako szczepy  Trichophyton mentagrophytes, musi się dobrze rozwijać. Inną płytkę zaszczepia się szczepem Aspergillus flavus, w którym musi być niewielki wzrost lub brak wzrostu. Dodatkowo, niezaszczepiona płytka jest inkubowana w celu wykazania jej sterylności.

Dla agaru Sabouraud z dekstrozą z cykloheksymidem, szczepy Candida albicans, Trichophyton rubrum  o Microsporum canis, co powinno wykazać dobry wzrost.

Podobnie napięcie Aspergillus flavus, wykazujący niewielki wzrost lub brak wzrostu. Na koniec inkubuj niezaszczepioną płytkę w celu kontroli jałowości.

Używa

Uprawa pierwotna

Klasyczny agar dekstrozowy Sabouraud zawiera 4 gramy dekstrozy i jest doskonały jako podstawowy ośrodek izolacyjny, ponieważ wykazuje charakterystyczną morfologię każdego grzyba.

Doskonale sprawdza się również w produkcji pigmentów. Nie jest to jednak najbardziej odpowiedni sposób na obserwowanie sporulacji.

Nie zaleca się również wzrostu Blastomyces dermatitidis, który jest hamowany przez wysokie stężenie obecnej glukozy.

Z drugiej strony, w celu kultywacji należy pamiętać o pewnych względach.

Niektóre grzyby rozwijają się lepiej w temperaturze pokojowej, takie jak pleśnie, inne rozwijają się pomyślnie w 37 ° C, podobnie jak niektóre drożdże, a inne mogą rozwijać się w obu temperaturach (grzyby dimorficzne).

Z tego powodu czasami konieczne jest użycie kilku płytek agarowych Sabourauda dla tej samej próbki, ponieważ często sadzi się je w dwóch powtórzeniach w celu inkubacji jednej płytki w temperaturze pokojowej i innej płytki w 37 ° C..

Na przykład, Sporothrix schenckii wysiewa się na dwie płyty; jeden jest inkubowany w temperaturze pokojowej w celu uzyskania fazy formy, a drugi jest inkubowany w temperaturze 37 ° C w celu uzyskania fazy drożdżopodobnej, ale w tym ostatnim konieczne jest dodanie 5% krwi do pożywki.

W innych przypadkach, podobnie jak w próbkach mycetomas, wysiewa się dwie płytki agaru Sabouraud, jedną z chloramfenikolem, a drugą z cykloheksymidem. Pierwszy pozwoli na wzrost czynników wywołujących grzybicę pochodzenia grzybowego (Eumicetoma) i drugi czynnik sprawczy grzybni pochodzenia bakteryjnego, takich jak promieniowce..

Sporulacja

Agar Sabourauda z dekstrozą zmodyfikowany przez Emmons zawiera 2 gramy dekstrozy i jest stosowany nie tylko do izolacji, ale także do sporulacji i ochrony grzybów.

W tym medium, jeśli możesz odzyskać szczepy Blastomyces dermatitidis.

Ochrona

Aby zachować kultury grzybów, można je przechowywać w lodówce (2-8 ° C). Czas przechowywania może wynosić od 2 do 8 tygodni. Po tym czasie muszą zostać poddani subkulturom, aby powtórzyć proces.

Niektóre grzyby najlepiej utrzymywać w temperaturze pokojowej, np. W temperaturze pokojowej Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum i Microsporum audounii.

Utrzymanie szczepu można wydłużyć, aby uniknąć pleomorfizmu, jeśli dekstroza zostanie całkowicie usunięta z agaru i jeśli zmniejszy się ilość agaru w podłożu, aby uniknąć suchości.

Mikrokultury

W celu identyfikacji niektórych grzybów nitkowatych konieczne jest przeprowadzenie mikrokultur przy użyciu agaru Sabourauda lub innych specjalnych środków do obserwacji struktur reprodukcji seksualnej i bezpłciowej.

W ludzkiej mikologii

Stosowany jest głównie do diagnozowania chorób grzybiczych, zwłaszcza tych, które wpływają na skórę i jej przywiązanie (włosy i paznokcie).

Próbkami mogą być wydzieliny, wysięki, skóra, włosy, paznokcie, plwocina, CSF lub mocz. Powszechnie izolowanymi patogenami są dermatofity, grzyby powodujące podskórne i ogólnoustrojowe zakażenia grzybicze.

Mikologia zwierzęca

Zwierzęta są często dotknięte infekcjami grzybiczymi, więc agar Sabourauda jest równie przydatny u zwierząt, jak w mikologii człowieka..

Na przykład, dermatofity mogą często wpływać na zwierzęta. Tak jest w przypadku Microsporum canis var distortum, które często zarażają psy, koty, konie, świnie i małpy. Podobnie, Microsporum gypseum zakaża psy, koty i bydło.

Ptaki takie jak kurczaki, koguty i kurczęta są dotknięte chorobą Microsporum gallinae.

Inne grzyby Zymonema farciminosum, są również przyczyną chorób u zwierząt, głównie u koni, mułów i osłów, powodując ważny stan zapalny w naczyniach limfatycznych.

Sporothrix schenkii i Histoplasma capsulatum dotyczą zwierząt domowych i ludzkich.

Mikologia środowiskowa

Wiele patogennych lub oportunistycznych grzybów można skoncentrować w danym momencie w danym środowisku, zwłaszcza w salach operacyjnych i oddziałach intensywnej terapii (OIOM) klinik i szpitali. Dlatego konieczne jest ich kontrolowanie.

Inne wrażliwe przestrzenie to biblioteki i stare budynki, na które może wpływać koncentracja grzybów środowiskowych.

W badaniach środowiskowych agar dekstrozowy Sabourauda stosuje się do izolacji grzybów.

Mikologia przemysłowa

Nie można zabraknąć agaru dekstrozowego Sabourauda do badania zanieczyszczeń grzybowych w produkcji kosmetyków, żywności, napojów, skóry, tekstyliów, między innymi.

Mikologia roślin

Rośliny cierpią również na choroby wywoływane przez grzyby, oddziałujące na różne części rośliny, które mogą nawet zakończyć żniwa, powodując duże straty w rolnictwie.

Referencje

  1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Diagnostyka mikrobiologiczna grzybic i badania wrażliwości na leki przeciwgrzybicze. Zalecenia Hiszpańskiego Towarzystwa Chorób Zakaźnych i Mikrobiologii Klinicznej. Dostępne pod adresem: coesant-seimc.org
  2. Laboratorium ValteK. (2009). Sabouraud agar dekstrozowy z cykloheksymidem. Dostępne pod adresem: andinamedica.com.
  3. Navarro O. (2013). Mikologia weterynaryjna. Narodowy Uniwersytet Rolniczy. Nikaragua.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnostyka mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Argentyna Panamericana S.A Editorial
  5. Casas-Rincon G. General Mycology. 1994. Wydanie drugie Universidad Central de Venezuela, wydania biblioteczne. Wenezuela, Caracas.