Podstawa, przygotowanie i stosowanie papy dekstrozy

The agar z papką dekstrozową jest stałym, nieselektywnym odżywczym podłożem hodowlanym. Może hodować gatunki bakterii i grzybów, ale jego zastosowanie jest wskazane zwłaszcza do izolacji grzybów nitkowatych i drożdży. Znany jest również jako medium PDA przez angielskie wyrażenie Potato Dextrose Agar.

Jest szczególnie przydatny do izolacji fitopatogennych grzybów, czyli tych, które wpływają na rośliny. Aby posadzić próbki z zainfekowanych roślin, można użyć innych pożywek, takich jak agar Sabourauda lub agar malta, jednakże do rutynowego stosowania agar z dekstrozą ziemniaczaną jest korzystniejszy ze względu na większą sporulację..

Jest również stosowany do liczenia kolonii grzybów w próbkach kosmetyków, farmaceutyków i niektórych produktów mlecznych. Podobnie, korzystne jest sadzenie próbek zeskrobin skóry w poszukiwaniu dermatofitów, które rosną bardzo dobrze w tym podłożu, rozwijając ich charakterystyczne pigmenty.

Podłoże z dekstrozy ziemniaczanej jest bardzo proste i łatwe do przygotowania w laboratorium. Zawiera, jak sama nazwa wskazuje, napar ziemniaczany, dekstrozę i agar-agar. Dodatkowo można dodawać substancje hamujące, aby zapobiec rozwojowi bakterii i zwiększyć selektywność dla gatunków grzybów.

Indeks

• 1 Fundacja
• 2 Przygotowanie
  • 2.1 - Domowy (niekomercyjny) preparat agaru z papką dekstrozową
  • 2.2 - Handlowy preparat agaru z papką dekstrozową
• 3 zastosowania
  • 3.1 Proces sadzenia próbek roślin na agarze z dekstrozą ziemniaczaną
  • 3.2 Proces sadzenia próbek skóry, włosów lub łusek paznokci na agarze z papką dekstrozową
  • 3.3 Procedura identyfikacji
  • 3.4 Liczba kolonii
  • 3.5 Utrzymanie szczepów grzybów
• 4 Kontrola jakości
• 5 referencji

Fundacja

Agar papa dekstrozowy jest pożywką, która dostarcza niezbędnych składników odżywczych dla rozwoju grzybów nitkowatych i drożdży.

Połączenie infuzji ziemniaka z glukozą stanowi doskonałe źródło energii dla zadowalającego wzrostu grzybów. Podczas gdy agar jest tym, który zapewnia spójność środowiska.

Samo podłoże nie hamuje wzrostu bakterii, więc jest podłożem nieselektywnym. Aby był selektywny, trzeba dodać substancje hamujące, takie jak kwas winowy lub antybiotyki.

Przygotowanie

-Domowy (niekomercyjny) preparat agaru z dekstrozą ziemniaczaną

Szalki Petriego

Jest przygotowany w następujący sposób:

Po pierwsze, ziemniaki są bardzo dobrze myte, usuwając brud, który mają. Są pocięte na cienkie plasterki ze wszystkim i skorupą. 200 g ziemniaków waży się i umieszcza w gotowaniu w litrze wody destylowanej przez pół godziny.

Po upływie czasu jest filtrowany lub przecedzany cały preparat przez gazę.

Uzyskana ciecz jest uzupełniana wodą destylowaną, aż osiągnie jeden litr. Do wlewu dodaje się 20 g agaru-agaru i 20 g dekstrozy, dobrze miesza i autoklawuje w 121 ° C, pod ciśnieniem 15 funtów przez 15 minut.

Pozostawić do ostygnięcia do 50 ° C i podawać w sterylnych szalkach Petriego. Przygotowane talerze są przechowywane w lodówce.

Kliny

Możesz również przygotować kliny agarowe z dekstrozą papa.

W tym przypadku, przed sterylizacją w autoklawie, 12 do 15 ml pożywki umieszcza się w probówkach, następnie autoklawuje i po opuszczeniu leży na specjalnych podporach aż do zestalenia. Zapisz w lodówce.

Pożywka pozostaje przy pH 5,6 ± 0,2, jednak niektóre laboratoria dodają 10% kwas winowy, aby obniżyć pH do 3,1 ± 0,1 w celu zahamowania wzrostu bakterii.

W tym samym sensie inne laboratoria wolą dodawać antybiotyki, aby były selektywne w uprawie grzybów i zapobiegały rozwojowi bakterii.

-Handlowy preparat agaru z dekstrozą ziemniaczaną

Odważyć 39 g dostępnego w handlu odwodnionego podłoża i rozpuścić w jednym litrze wody destylowanej. Pozostaw w spoczynku na 5 minut.

Mieszaninę ogrzewa się przez częste mieszanie aż do całkowitego rozpuszczenia. Następnie sterylizowano w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut.

Płyty lub kliny mogą być przygotowane. Postępuj jak opisano powyżej.

PH pozostaje na poziomie 5,6 ± 0,2. Jeśli pożądane jest pH 3,1, należy dodać 14 ml 20% sterylnego kwasu winowego przed podaniem na płytki..

Barwa nieprzygotowanego podłoża jest beżowa i przygotowana jest jasnobursztynowa o lekko mętnym lub opalizującym wyglądzie.

Używa

Proces sadzenia próbek roślin w agarze z dekstrozą ziemniaczaną

-Do liści z plamami

Liście są cięte na kawałki.

W szklance o pojemności 50 cm3 z 50% alkoholem umieść kawałki liści (zabarwione i zdrowe), aby zdezynfekować powierzchnię przez 20 do 30 sekund. Pociągnij alkohol i dodaj 20% podchloryn sodu na 40 do 50 sekund, jeśli są to cienkie liście i zwiększ czas do 80 sekund, jeśli jest to kora i kłody.

Wyciągnij podchloryn sodu i sterylnym klipsem zdejmij zdezynfekowane kawałki i umieść je na powierzchni medium (maksymalnie 10 sztuk). Umieść datę i inkubuj od 20 do 30 ° C.

-Na owoce i bulwy

Jeśli owoc jest mięsisty, otwórz owoce dotknięte grzybem i zabierz kawałki sterylnym skalpelem, zarówno chorą częścią, jak i zdrową częścią, i umieść je na powierzchni agaru.

Jeśli owoc jest cytrusowy, taki jak cytryna lub pomarańcza, należy otworzyć i wysiać nasiona.

Gdy powierzchnia owocu jest naruszona i obserwuje się zarodniki, najlepiej jest zastosować na tarce metodę startą; polega to na dotykaniu zarodników szpachelką w formie „L” sterylizowanej i chłodzonej, a następnie wykonywaniu zygzakowatego wysiewu 2–3 razy na agarze.

-Na ziarna

Są dezynfekowane zgodnie z opisem w liściach, a następnie umieszczane na agarze.

-Do gałęzi i łodyg

Wykonuje się skrobanie kory, a następnie pobiera części zdrowej i chorej części i wysiewa bezpośrednio na agarze..

Wysiane płytki inkubuje się w aerobiozie w 20-30 ° C przez 72 godziny.

Proces sadzenia próbek skóry, włosów lub łusek paznokci na agarze z papką dekstrozową

Próbka musi zostać pobrana za pomocą ostrza skalpela nr 11, aby wyciąć zaatakowane włosy, płatki skóry lub paznokcie w poszukiwaniu dermatofitów. Przed pobraniem próbki obszar należy zdezynfekować 70% alkoholem.

-Próbka skóry

W łuszczących się zmianach należy zeskrobać krawędź zmiany, ponieważ istnieje większe prawdopodobieństwo znalezienia grzyba.

W zmianach wysiękowych próbkę pobiera się suchym lub mokrym wacikiem. Zasiej natychmiast na agarze z dekstrozą ziemniaczaną lub agarze Sabouraud. Unikaj środków transportu.

Inną metodą pobierania próbek jest technika dywanów z Mariat i Adan Campos. W tym przypadku dotknięty obszar jest wcierany 5 razy kawałkiem sterylnej wełny do dalszej uprawy.

Próbkę można umieścić bezpośrednio w pożywce hodowlanej.

-Próbka włosów

W zależności od patologii dotknięta część może zostać odcięta lub oderwana przez korzenie. Umieść próbkę w pożywce hodowlanej.

-Próbka paznokcia

Możesz zeskrobać lub wyciąć określoną część dotkniętego paznokciem. Zależy to od rodzaju obrażeń.

Przed wysiewem pociąć próbkę na kawałki o średnicy 1 mm, aby zwiększyć prawdopodobieństwo kontaktu grzyba z pożywką hodowlaną.

Procedura identyfikacji

Kolonie otrzymane na płytce izoluje się w probówkach zawierających agar z dekstrozą ziemniaczaną w celu przeprowadzenia badania makroskopowego kolonii (wygląd, kolor, konsystencja, stopień rozwoju)..

Badanie mikroskopowe (obserwacja struktur i ich formacji) może być wykonane przez mikrokultury lub bezpośrednią obserwację pod mikroskopem między blaszką i blaszką.

Liczba kolonii

Pożywka ta może być również używana do określania ładunku grzybów i drożdży obecnych w próbkach roślin, żywności, kosmetykach lub lekach. W tym celu stosuje się agar z dekstrozą z dodatkiem antybiotyków, taki jak: (chloramfenikol, chlorotetracyklina lub oba).

Wlać 1 ml próbki - najlepiej rozcieńczonej - do sterylnej i pustej szalki Petriego, a następnie stopić wkładkę agarową z dekstrozą ziemniaczaną i ostudzić do 45 ° C. Wlać szalkę Petriego i obracać aż do homogenizacji. Pozostaw w spoczynku, aż się zestali.

Inkubować w aerobiozie w 20-25 ° C (pleśnie) lub w 30-32 ° C (drożdże) przez 5 do 7 dni lub dłużej, w zależności od rodzaju poszukiwanego grzyba i rodzaju próbki. Dwie płytki można wykorzystać do inkubacji w obu zakresach temperatur.

Konserwacja szczepów grzybów

Agar papa-dekstrozowy można stosować do utrzymania żywotnych szczepów grzybów przez kilka lat.

Aby to zrobić, grzyb jest uprawiany w klinach z agarem z dekstrozą papki i po wyhodowaniu grzyba jest pokryty olejem mineralnym. Olej musi być sterylizowany w autoklawie przez 45 minut i mieć przybliżoną lepkość od 300 do 330 Saybolt. Olej powinien przekraczać końcówkę fazowaną o 1 do 2 cm.

Kontrola jakości

Z każdej przygotowanej partii należy pobrać jedną lub dwie płytki i inkubować w temperaturze 25 ° C przez 48 godzin lub w temperaturze 20 ° C przez 96 godzin. Dobra kontrola sterylności to taka, w której nie ma rozwoju kolonii.

Znane lub certyfikowane szczepy kontrolne, takie jak:

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533. We wszystkich przypadkach oczekuje się dobrego wzrostu.

Referencje

1. Laboratories Britania. Agar papa glucosado. 2015. Dostępny na: britanialab.com
2. Neogen Laboratories Agar z dekstrozą ziemniaczaną. Dostępne pod adresem: foodsafety.neogen.com
3. Insumolab Laboratory Agar z dekstrozą ziemniaczaną. Dostępne pod adresem: insumolab.cl
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostyka mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana S.A. Argentyna.
5. Casas-Rincon G. General Mycology. 1994. Wydanie drugie Universidad Central de Venezuela, wydania biblioteczne. Wenezuela, Caracas.
6. Aceituno M. Ocena jakości mikrobiologicznej w cieniu do powiek, rodzaj kompaktowego proszku krajowego laboratorium produkcyjnego, zgodnie z metodą referencyjną Pharmacopeia Usp 2005. Teza kwalifikująca się do tytułu farmaceuta chemik Uniwersytet San Carlos de Gwatemala.
7. Cuétara M. Przetwarzanie próbek powierzchniowych. Iberoamerican Mycology Magazine. 2007; pp. 1-12