Fundacja Agar Müeller Hinton, przygotowanie i zastosowania

The Agar Müellera Hintona Jest to stała, nieselektywna pożywka, która składa się z naparu mięsnego, peptonu z kwasu kazeinowego, skrobi, agaru i wody destylowanej. Pożywka ta umożliwia doskonały rozwój drobnoustrojów najbardziej szybko rosnących bakterii.

Został on pierwotnie stworzony przez Johna Howarda Müellera i Jane Hintona w celu wyizolowania wymagających pokarmowo bakterii, takich jak Neisseria gonorrhoeae i Neisseria meningitidis. Jednak ze względu na swoje właściwości okazał się idealny do badania podatności na antybiotyki, zapewniając wiarygodne i powtarzalne wyniki.

Z tego powodu agar Müeller Hinton jest pożywką akceptowaną przez Instytut Standardów Klinicznych i Laboratoryjnych (CLSI) oraz Europejski Komitet ds. Testowania Podatności Przeciwdrobnoustrojowej do wykonania testu wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe metodą dyfuzji krążka Kirby. Bauer.

Indeks

• 1 Fundacja
• 2 Przygotowanie
• 3 zastosowania
  • 3.1 Technika przeciwdrobnoustrojowa
  • 3.2 Strategiczne rozmieszczenie krążków na agarze Müeller Hinton
• 4 Przyczyny błędnych wyników
• 5 Ograniczenie
• 6 Kontrola jakości
• 7 referencji

Fundacja

Ponieważ jest to nieselektywna pożywka, doskonale nadaje się do wzrostu większości bakterii chorobotwórczych.

Z drugiej strony, jego prosty skład sprawia, że ​​substancje łatwo się na nim dyfundują, będąc istotną cechą testu podatności metodą dyfuzji dysku..

Inną jego cechą jest to, że zawiera małą ilość inhibitorów, co pozwala skutecznie oceniać sulfonamidy, trimetoprim i tetracykliny..

Należy jednak pamiętać, że medium musi spełniać pewne warunki, aby zapewnić jego prawidłowe funkcjonowanie, w tym:

Regulacja pH, głębokość agaru i odpowiednie stężenie tyminy, tymidyny, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ i Zn⁺⁺.

Musimy również wiedzieć, że metodologia jest znormalizowana i dlatego muszą być spełnione wszystkie parametry, takie jak:

Stężenie inokulum, stężenie i konserwacja krążków antybiotykowych, umieszczenie odpowiedniej liczby krążków na agarze, odległość między jednym krążkiem a drugim, strategiczne rozmieszczenie niektórych antybiotyków, atmosfera, temperatura i czas inkubacja.

Przygotowanie

Odważ 37 g odwodnionego podłoża Müeller Hinton i rozpuść w 1 litrze wody destylowanej. Podgrzej medium, mieszając, aby je rozpuścić. Pozwól gotować przez 1 minutę.

Weź autoklaw do sterylizacji w temperaturze 121 ° C przez 15 minut. Podczas wyjmowania z autoklawu fiolkę należy umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 50 ° C, aby ostygła. Wlej 25 do 30 ml do sterylnych szalek Petriego o średnicy 10 cm.

Płyty powinny mieć średnią grubość 4 mm (idealna), z dopuszczalnym zakresem 3-5 mm.

Jeśli pożądane jest przygotowanie agaru z krwią przy użyciu podłoża agarowego Müeller Hinton, przed podaniem na talerze wlewa się 5% sterylnej i defibryfikowanej krwi jagnięcej..

Końcowe pH podłoża powinno wynosić od 7,2 do 7,4.

Zainwestuj i przechowuj w lodówce, aż do użycia. Przed użyciem pozostaw płytkę do temperatury pokojowej.

Kolor przygotowanego podłoża jest jasny beżowy.

Używa

Stosuje się go do wykonania testu na antybiogram lub wrażliwość na antybiotyki na większość szybko rosnących patogenów.

Jeśli agar jest uzupełniony krwią, służy do wykonania antybiogramu wymagających mikroorganizmów, takich jak: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, między innymi. Został również użyty do izolacji Legionella pneumophila.

Technika antybiogramowa

Przed wykonaniem antybiogramu należy przygotować roztwór bakteryjny równoważny 1,5 x 10⁸ komórki.

W tym celu pobiera się od 3 do 4 kolonii z czystej hodowli i zawiesza w bulionie sojowym z tryptykazą lub w bulionie Müeller Hinton, inkubuje przez 2 do 6 godzin, a stężenie dostosowuje się sterylnym roztworem soli fizjologicznej, porównując je ze standardem Mac Farland. 0,5%.

Jeśli są wymagającymi mikroorganizmami, kolonie można zawiesić bezpośrednio, aż osiągną stężenie 0,5% Mac Farland. Następnie płytkę Müeller Hinton wysiewa się wacikiem nasączonym przygotowanym roztworem bakteryjnym.

Aby to zrobić, zanurz wymazówkę w roztworze, a następnie usuń nadmiar płynu naciskając na ścianki probówki. Natychmiast po przejściu wymazu przez całą powierzchnię, nie pozostawiając nietkniętych miejsc, delikatnie obróć płytkę i ponownie zasiej. Operacja jest powtarzana jeszcze 2 razy.

Odstawić na 10 minut, a następnie umieścić krążki antybiotyków za pomocą jałowych kleszczy, pozostawiając odstęp 24 mm między nimi. Po umieszczeniu każdego krążka na agarze lekko naciskaj każdy z nich zaciskiem, aby upewnić się, że są dobrze przyklejone.

Po procesie płytkę odwraca się i inkubuje w 35-37 ° C w aerobiszu przez 16 do 18 godzin. Jeśli jest to wymagający mikroorganizm, może wymagać mikroaerofilii, a jeśli antybiogram zawiera krążki oksacylinowe, należy go odczytać po 24 godzinach.

Do pomiaru średnicy każdego aureoli służy linijka. Wyniki należy zapisać w mm. Następnie uzyskane wartości są skorelowane z tabelami punktów cięcia opublikowanymi przez obecny podręcznik CLSI.

Zgłoś jako wrażliwe (S), pośrednie (I) lub odporne (R), w zależności od przypadku.

Antybiotyki dobiera się w zależności od wyizolowanego mikroorganizmu i rodzaju występującego zakażenia.

Czasami należy rozważyć strategiczne rozmieszczenie antybiotyków, aby wykazać fenotypowe wzorce oporności.

Strategiczne rozmieszczenie krążków na agarze Müeller Hinton

W przypadku enterobakterii krążek kwasu klawulanowego należy umieścić przed cefalosporynami trzeciej i czwartej generacji. Rozszerzenie w kształcie jajka wskazuje, że szczep jest producentem beta-laktamaz o rozszerzonym spektrum działania (ESBL). Oznacza to, że pacjent nie powinien być leczony żadną cefalosporyną.

W gronkowcu ważne jest umieszczenie krążka erytromycyny lub azytromycyny przed krążkiem klindamycyny (test D).

Odporny halo w erytromycynie i spłaszczenie w halo klindamycyny wskazuje, że szczep ma indukowalną odporność na klindamycynę, szczep (RIC). Oznacza to, że leczenie klindamycyną nie będzie skuteczne.

W poszukiwaniu indukowalnych szczepów AMP C u Enterobacteriaceae i niektórych niefermentujących pałeczek Gram-ujemnych, dyski ceftazydymu, cefoksytyny lub piperacyliny tazobaktanu są konfrontowane z dyskiem imipenemowym, w odległości 27 mm.

Aureola spłaszczona na jednym z krążków stojących przed imipenemem wskazuje na obecność indukowanego AMP C.

W poszukiwaniu konstytutywnego AMP C, dysk 500 μg kloksacyliny jest skierowany na ceftazydym (30 μg) i cefotaksym (30 μg) w odległości 25 mm. Rozszerzona aureola w jednej z cefalosporyn wskazuje na pozytywność.

Krążek kloksacyliny można również zastąpić 9 mm krążkiem bibuły filtracyjnej Whatman nr 6 impregnowanej kwasem fenyloboronowym (400 μg) w odległości 18 mm. Jest interpretowany tak samo jak poprzedni.

Wreszcie, aby zbadać produkcję metalo-beta-laktamaz, zwłaszcza w Pseudomonas aeruginosa, dysk impregnowany 10 μl kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA 750 μg) i kwasu tioglikolowego (SMA 300 μg), który jest skierowany na dyski imipenemowe i meropenem, jest używany w odległości 15 mm.

Test jest dodatni, jeśli imipenem lub halo z meropenemem rozszerza się w kierunku dysku EDTA / SMA. Wynik ten musi zostać potwierdzony zmodyfikowanym testem Hodge'a.

Metoda ta polega na zaszczepieniu szczepu Escherichia coli ATCC 25922 na płycie Müeller Hinton. Dysk imipenemowy umieszcza się w środku płyty, a następnie wykonuje się flet z dysku w kierunku obrzeża z naprężeniem P. aeruginosa podejrzany Możesz przetestować do 4 szczepów na płytkę.

Test będzie pozytywny, jeśli strefa zniekształceń halo imipenemu będzie otaczać rozstępy.

Przyczyny błędnych wyników

-Płyty słabo konserwowanych antybiotyków mogą powodować fałszywe opory. Na przykład dysk oksacylinowy jest bardzo podatny na zmiany temperatury.

-Wartość pH pożywki poniżej wskazanej (kwas) wytwarza mniejsze aureole w aminoglikozydach i makrolidach (ryzyko fałszywej oporności), a większe aureole w penicylinie, tetracyklinie i nowobiocynie (ryzyko fałszywej wrażliwości).

-Jeśli pH jest powyżej wskazanego (alkalicznego), opisane powyżej efekty są odwrócone.

-Pożywki o wysokich stężeniach tyminy i tymidyny wpływają znacząco na zmniejszenie hamowania halonów sulfonamidów i trimetoprimu.

-Wysokie stężenia wapnia i magnezu powodują fałszywa oporność aminoglikozydów, polimyksyny B i tetracyklin na szczepy Pseudomonas aeruginosa.

-Niskie stężenia wapnia i magnezu powodują fałszywe wrażliwości aminoglikozydów, polimyksyny B i tetracyklin na szczepy Pseudomonas aeruginosa.

-Obecność cynku wpływa na wyniki krążków karbapenemów (imipenem, meropenem i ertapenem).

-Grubość medium poniżej 3 mm daje fałszywe wyniki czułości, podczas gdy grubość powyżej 5 daje fałszywą odporność.

-Mobilizacja krążków w antybiogramie da zniekształcone halo, ponieważ wypływ antybiotyku jest natychmiastowy.

- Bardzo słabe inokulum wpływają na wyniki, ponieważ nie będzie jednolitego lub zlewającego się wzrostu w agarze, co jest warunkiem koniecznym do zmierzenia stref zahamowania, oprócz tego, że aureole mogą dawać większe niż normalnie.

-Przeciążone inokulum może dawać aureole mniejsze niż normalnie.

-Nieprzestrzeganie odległości między płytami powoduje, że jedna aureola nakłada się na inną i nie można jej poprawnie odczytać.

-Inkubuj z CO₂ zwiększa rozmiar aureoli krążków tetracykliny i metycyliny.

-Inkubacja w temperaturze poniżej 35 ° C powoduje powstanie większych aureoli.

-Dodatek krwi zmniejsza wielkość halo sulfonamidów.

Ograniczenie

Wrażliwość antybiotyku wykazanego w antybiogramie przeciwko drobnoustrojowi (in vitro) nie gwarantuje, że będzie działać in vivo.

Kontrola jakości

Aby wiedzieć, czy podłoże zawiera odpowiednią ilość tyminy, należy wysiać szczep Enterococcus faecalis ATCC 29212 i sprawdzić podatność na trimetoprim sulfametoksazol (SXT), powinien dać halo równe lub> 20 mm, aby było zadowalające.

Referencje

1. „Agar Müller-Hinton”. Wikipedia, darmowa encyklopedia. 16 listopada 2018, 12:23 UTC. 27 stycznia 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostyka mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana S.A. Argentyna.
3. Cona E. Warunki dobrego badania wrażliwości na podstawie testu dyfuzji agaru. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Laboratorium Difco Francisco Soria Melguizo. Agar Müeller Hinton z 5% krwią owczą. 2009. Dostępny pod adresem: http://f-soria.es
5. Laboratorium BD Müeller Hinton II Agar. 2017. Dostępny pod adresem: .bd.com
6. Laboratories Britania. Agar Müellera Hintona. 2015. Dostępny na: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnostyka mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana S.A. Argentyna.
8. Martínez-Rojas D. Betalactamasas typ AmpC: Ogólne i metody wykrywania fenotypowego. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Dostępne pod adresem: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotypowa detekcja metalobetalaktamaz w izolatach klinicznych Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Dostępne pod adresem: scielo.org.