Agar Fundacja M.R.S, przygotowanie i zastosowania

The agar M.R.S. jest selektywną stałą pożywką hodowlaną, stosowaną do izolacji i liczenia bakterii kwasu mlekowego, zwłaszcza rodzaju Lactobacillus. Agar ten został stworzony w 1960 r. Przez Mana, Rogosę i Sharpe'a, środkowego noszącego tę samą nazwę, ale ze względu na swoją złożoność często używany jest skrót M.R.S..

Składa się z peptonu proteozowego, ekstraktu mięsnego, ekstraktu drożdżowego, glukozy, monoleinianu sorbitanu, fosforanu dipotasowego, octanu sodu, cytrynianu amonu, siarczanu magnezu, siarczanu manganu i agaru..

Kompozycja ta umożliwia prawidłowy rozwój bakterii kwasu mlekowego z próbek klinicznych, takich jak odchody, wydzielina z pochwy, próbki doustne i mleko matki, a także produkty mleczne i mięsne..

Nie jest rutynowo stosowany w laboratoriach klinicznych, ponieważ bakterie kwasu mlekowego rzadko biorą udział w procesach patologicznych. Jednak stosowanie agaru M.R.S jest częstsze w dziedzinie mikrobiologii żywności..

Z drugiej strony, to medium jest wykorzystywane przez niektóre ośrodki badawcze, których celem jest badanie bakterii kwasu mlekowego.

Indeks

• 1 Fundacja
• 2 Przygotowanie
• 3 zastosowania
  • 3.1 Charakterystyka kolonii
  • 3.2 Izolacja bakterii kwasu mlekowego
  • 3.3 Zliczanie bakterii kwasu mlekowego
  • 3.4 Na poziomie badań
• 4 Kontrola jakości
• 5 referencji

Fundacja

Agar Man, Rogosa i Sharpe ma dość złożoną kompozycję. Dzieląc funkcję, jaką spełnia każdy z jej składników, można wyjaśnić jego podstawy.

Pepton białkowy, ekstrakt mięsny, ekstrakt drożdżowy i glukoza to składniki odżywcze, które dostarczają źródła węgla, azotu, witamin i minerałów niezbędnych do rozwoju bakterii. Ponadto glukoza jest uniwersalnym źródłem energii wykorzystywanym w większości pożywek hodowlanych.

Z drugiej strony, w celu sprzyjania wzrostowi bakterii kwasu mlekowego, konieczna jest obecność niezbędnych kofaktorów (kationów) w metabolizmie Lactobacillus i pokrewnych bakterii; Związki te są solami sodu, magnezu i manganu.

Podobnie monoleinian sorbitanu lub polisorbat 80 są źródłem ważnych kwasów tłuszczowych, gdy są wchłaniane jako składniki odżywcze.

Ponadto, monoleinian sorbitanu i cytrynian amonu działają poprzez hamowanie rozwoju flory towarzyszącej, zwłaszcza bakterii Gram-ujemnych, zapewniając selektywny charakter tego agaru.

Wreszcie agar-agar nadaje środkowi stałą konsystencję.

Istnieją inne warianty agaru Man Rogosa Sharpe; jednym z nich jest suplementacja cysteiną (M.R.S.c), bardzo przydatna do izolacji bifidobakterii, wśród innych mikroorganizmów. Z drugiej strony istnieje pożywka MRS uzupełniona neomycyną, paromomycyną, kwasem nalidyksowym i chlorkiem litu, szczególnie do selektywnego liczenia bifidobakterii w produktach mlecznych.

Przygotowanie

Odważyć 68,25 g odwodnionego podłoża i rozpuścić w jednym litrze wody destylowanej. Odstaw na 5 minut. Aby rozpuścić się w całości, przynieś do źródła ciepła często mieszając i pozwól wrzeć przez 1 do 2 minut. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 ° C przez 15 minut.

Po wyjściu z autoklawu odstaw na kilka minut i rozprowadź jeszcze gorącą sterylną szalkę Petriego.

Pozostawić do zestalenia i odwrócenia płytek, zamówić w plaquers i przechowywać w lodówce do czasu użycia. Pozwól płytom na uzyskanie temperatury pokojowej przed ich użyciem.

PH pożywki powinno wynosić 6,4 ± 0,2. Niektóre domy komercyjne zalecają pH w zakresie od 5,5 do 5,9.

Odwodnione podłoże jest beżowe i przygotowane w ciemnym bursztynie.

Zarówno odwodnione podłoże, jak i przygotowane płytki należy przechowywać w temperaturze od 2 do 8 ° C.

Używa

Płytki agarowe M.R.S. mogą być wysiewane na powierzchni (wyczerpanie lub szpatułką Drigalskiego). Można go również wysiać według głębokości. Płytki należy inkubować w temperaturze 37 ° C w mikroaerofilach (4% O₂ i 5-10% CO₂) przez 24 do 72 godzin.

Metoda wysiewu jest wybierana zgodnie z zamierzonym celem (izolacja lub liczenie).

Charakterystyka kolonii

Przypuszczalne kolonie Lactobacillus rosną białawe i mają śluzowaty lub kremowy wygląd na tym agarze. Potem muszą się zidentyfikować.

Izolacja bakterii kwasu mlekowego

W tym celu stosuje się sadzenie po powierzchni. Próbki do sadzenia wymagają wcześniejszej procedury. 

W przypadku próbek mleka matki zaleca się odwirować 1 ml próbki przy 14 000 obr./min przez 10 minut, aby usunąć warstwę tłuszczową. Odrzuca się 900 μl, aw pozostałych 100 μl osad zawiesza się i wylewa na M.R.S. Następnie musi być równomiernie rozprowadzony szpatułką Drigalskiego.

W przypadku próbek kału jeden (1) gram kału waży się i homogenizuje w 9 ml 0,1% sterylnej wody z dodatkiem peptonów, co odpowiada rozcieńczeniu 1/10. Następnie wykonuje się seryjne rozcieńczenia, aż do uzyskania końcowego rozcieńczenia 10^-4.

Na koniec pobiera się 100 μl rozcieńczeń 10^-2, 10^-3 i 10^-4 i każde rozcieńczenie wysiewa się na agarze MRS, rozprowadzając równomiernie szpatułką Drigalskiego.

Zliczanie bakterii kwasu mlekowego

W tym przypadku wysiew odbywa się według głębokości.

W przypadku próbek mleka matki weź 1 ml i umieść go w sterylnej stożkowej plastikowej probówce. Agar MRS dodaje się w temperaturze około 40 ° C do końcowej objętości 25 ml, uzyskując jednorodną mieszaninę. Następnie wylewa się na sterylne płytki Petriego w jednolity sposób i pozostawia do odstania, aż ulegnie polimeryzacji..

Rozcieńczenia sporządza się dla próbek kału, jak opisano powyżej. Weź 1 ml każdego rozcieńczenia i umieść w sterylnych stożkowych plastikowych probówkach. Stopiony agar MRS dodaje się do objętości 25 ml.

Mieszaninę każdego rozcieńczenia wlewa się równomiernie do sterylnych płytek Petriego. Na koniec odstaw do polimeryzacji.

Na poziomie badawczym

Każdego dnia badania nad bakteriami kwasu mlekowego stają się bardziej interesujące; szczególnie naukowcy starają się poznać nowe szczepy i ich potencjał jako inicjatorów fermentacji do standaryzacji w produkcji produktów mlecznych, między innymi.

W tym sensie Alvarado i in. (2007) użył agaru M.R.S. przeprowadzić badanie, w którym wyizolowali, zidentyfikowali i scharakteryzowali bakterie kwasu mlekowego obecne w wędzonym serze wenezuelskim.

W serze stwierdzono obecność bakterii z rodzajów Lactococcus i Lactobacillus i stwierdzono, że mieszaniny izolowanych szczepów nadają się jako szczepy startowe do produkcji serów z mleka pasteryzowanego.

Z drugiej strony, Sánchez i in. (2017) użył agaru M.R.S. zbadać obecność bakterii kwasu mlekowego w przewodzie pokarmowym prosiąt, aby wykorzystać je jako rodzime probiotyki, które zwiększają produktywność zdrowych prosiąt.

Dzięki temu medium udało się wyizolować cztery gatunki: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae i Pediococcus pentosaceus.

Podobnie Báez i in. (2019) użył agaru M.R.S. ocenić bakterie kwasu mlekowego (BAL) i bifidobakterie o potencjale probiotycznym w mleku matki i odchodach niemowląt.

Udało im się wyizolować 11 BAL i 3 Bifidobacteria sp w mleku matki i 8 BAL i 2 Bifidobacteria sp. w stolcu Wszystkie spełniały pewne parametry, które akredytują je jako bakterie o aktywności probiotycznej.

Autorzy doszli do wniosku, że zarówno mleko matki, jak i odchody wyłącznie karmionych piersią niemowląt stanowią naturalne źródło bakterii probiotycznych.

Kontrola jakości

Aby ocenić jakość M.R.S. można stosować szczepy kontrolne, takie jak:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli i Bacillus cereus.

Oczekiwane wyniki to zadowalający wzrost dla pierwszych 6 bakterii E. coli i Bacillus cereus musi zostać zahamowany w całości.

Referencje

1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Izolacja, identyfikacja i charakterystyka bakterii kwasu mlekowego z andyjskiego ręcznie wędzonego sera wenezuelskiego. Jego zastosowanie jako uprawa startowa. Naukowiec (Maracaibo) 2007; 17 (3): 301-308. Dostępne pod adresem: scielo.org.
2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro Izolacja bakterii kwasu mlekowego z przewodu pokarmowego Prosiaczka. Rew. weterynarz. Peru 2017; 28 (3): 730-736. Dostępne pod adresem: scielo.org.
3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Ocena bakterii kwasu mlekowego i Bifidobacteria o potencjale probiotycznym w mleku matki i odchodach niemowląt w gminie Acevedo, Miranda 2017. Praca licencjacka w celu uzyskania tytułu licencjata w Bioanaliza University of Carabobo, Wenezuela.
4. British Laboratory Agar M.R.S. 2015. Dostępny na: britanialab.com
5. Twórcy Wikipedii. Agar MRS Wikipedia, wolna encyklopedia. 10 stycznia 2018, 19:44 UTC. Dostępne pod adresem: wikipedia.org Dostęp 17 lutego 2019 r.
6. Roy D. Media do izolacji i oznaczania liczby bifidobakterii w produktach mlecznych. Int J Food Microbiol, 200128; 69 (3): 167-82.