Podstawa, przygotowanie i stosowanie Agar EMB



The Agar EMB jest selektywną i różnicową stałą pożywką hodowlaną stosowaną do izolacji Gram-ujemnych pałeczek, głównie z rodziny Enterobacteriaceae, i innych nie wymagających bakterii Gram-ujemnych. Znany jest również pod skrótem EAM, co oznacza błękit eozynowo-metylenowy.

To medium zostało stworzone przez Holta-Harrisa i Teague w 1916 roku. Zawiera pepton, laktozę, sacharozę, fosforan dipotasowy, agar, eozynę, błękit metylenowy i wodę. Jest bardzo podobny do agaru MacConkeya, zwłaszcza jeśli stosuje się agar EMB zmodyfikowany przez Levine, który nie zawiera sacharozy.

W rzeczywistości każde laboratorium decyduje, czy działa z jednym czy drugim, ponieważ spełniają tę samą funkcję, chociaż biochemicznie są różne.

Prezentuje nawet tę samą wadę, co klasyczny agar MacConkey pod względem produkcji roju przez rodzaj Proteus. Dlatego, aby uniknąć tego zjawiska, można zwiększyć stężenie agaru do 5%.

Indeks

  • 1 Fundacja
    • 1.1 Selektywne
    • 1.2 Różnicowy
  • 2 Przygotowanie
  • 3 zastosowania
  • 4 Kontrola jakości
  • 5 Uwagi końcowe
  • 6 referencji

Fundacja

Selektywny

Agar EMB jest subtelnie selektywny, ponieważ zawiera anilinowe barwniki (eozynę i błękit metylenowy), które działają jak inhibitory, zapobiegając wzrostowi większości bakterii Gram-dodatnich i niektórych wymagających pałeczek Gram-ujemnych..

Jednakże ten agar ma tę wadę, że niektóre bakterie Gram-dodatnie mogą opierać się obecności substancji hamujących i rosnąć jako małe bezbarwne punktowe kolonie, takie jak Enterococcus faecalis i trochę Staphylococcus.

Możesz także uprawiać niektóre drożdże, takie jak Kompleks Candida albicans, Daje bardzo małe różowe kolonie. Nawet chlamydospory można rozwijać z tych drożdży, jeśli próbka jest wysiewana według głębokości.

Różnicowy

Z drugiej strony, agar EMB jest również medium różnicowym, ponieważ te barwniki razem (eozyna i błękit metylenowy) mają właściwość tworzenia osadu przy kwaśnym pH, dlatego służą jako wskaźniki jego wytwarzania..

Dlatego słabo fermentująca laktoza lub bakterie sacharozy wytwarzają purpurowe kolonie w ciągu 24 do 48 godzin. Na przykład rodzaje Klebsiella, Enterobacter i Serratia.

Te bakterie, które silnie fermentują laktozę, takie jak Escherichia coli, lub sacharoza, jak Yersinia enterocolitica o Proteus penneri, tworzą zielonkawo czarny osad, dając metaliczny charakter połysku u tych gatunków.

Należy zauważyć, że jeśli stosuje się medium levine EMB (bez sacharozy), Yersinia enterocolitica i Proteus penneri wytworzą przezroczyste kolonie.

Bakterie, które nie fermentują laktozy lub sacharozy, odżywiają się obecnością peptonów, które dostarczają aminokwasów i azotu niezbędnych do rozwoju bakterii i wytwarzają przezroczyste kolonie. Na przykład między innymi rodzaje Salmonella i Shigella.

Podobnie ważne jest, aby zauważyć, że rodzaj Acinetobacter może prezentować kolonie błękitu lawendowego, nawet jeśli nie jest fermentorem laktozy, ani sacharozy, ale ma właściwość wiązania błękitu metylenowego w ścianie komórkowej. Może się to również zdarzyć w przypadku innych bakterii utleniających.

Przygotowanie

Pierwotnym odwodnionym podłożem jest jasny beż.

W celu przygotowania tej pożywki hodowlanej należy zważyć 36 gramów odwodnionej pożywki i zawiesić ją w fiolce zawierającej jeden litr wody destylowanej.

Po pozostawieniu mieszaniny na 5 minut w spoczynku, doprowadzić fiola do źródła ciepła, mieszając energicznie i stale, aż się zagotuje i całkowicie się rozpuści..

Następnie rozpuszczoną pożywkę hodowlaną należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 ° C przez 15 minut.

Pod koniec czasu wyjmuje się go z autoklawu i pozostawia na chwilę do odpoczynku. Następnie podawany jest nawet gorący (45 - 50 ° C) od 15 do 20 ml agaru na każdej sterylnej szalce Petriego. Medium powinno być niebieskie lakmus.

Po podaniu talerze pozostawia się lekko odsłonięte, aż agar trochę się ochłodzi. Następnie są przykryte i całkowicie zestalone. Później są one zamawiane w odwróconym uchwycie płytki nazębnej i przechowywane w lodówce (8 ° C), dopóki nie zostaną użyte.

Ta procedura jest korzystnie przeprowadzana w komorze z przepływem laminarnym lub przed palnikiem Bunsena, aby uniknąć zanieczyszczenia.

Ważne jest, aby pamiętać, że każdy dom handlowy wskaże ilość do zważenia w celu przygotowania podłoża hodowlanego.

Końcowe pH pożywki powinno wynosić 7,2 ± 0,2

Używa

Pożywkę tę stosuje się do wysiewu moczu i kału lub dowolnego rodzaju próbek klinicznych, zwłaszcza jeśli podejrzewa się obecność niewymagających pałeczek Gram-ujemnych, takich jak laseczki należące do rodziny Enterobacteriaceae, które bardzo dobrze rosną w tej pożywce.

Enteropatogenne bakterie z rodzajów Shigella i Salmonella wyróżniają się bezbarwnymi lub lekko bursztynowymi koloniami.

Rosną także inne niefermentujące laktozy, takie jak między innymi Aeromonas, Pseudomonas, Acinetobacter..

Podobnie, to medium jest bardzo przydatne w analizie mikrobiologicznej żywności i wody, ponieważ jest idealne do pełnej fazy potwierdzającej oznaczanie bakterii z grupy coli, to znaczy do potwierdzenia obecności E. coli z mętnych bulionów EC, z najbardziej prawdopodobnej techniki numerycznej (NMP).

Kontrola jakości

Aby sprawdzić, czy nowo hodowana pożywka hodowlana działa dobrze, można posadzić szczepy kontrolne, aby obserwować cechy kolonii i sprawdzić, czy dają one zgodnie z oczekiwaniami.

W tym celu szczepy ATCC lub dobrze zidentyfikowane szczepy E. coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella sp, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa i niektóre bakterie Gram-dodatnie, jak S. aureus.

Oczekuje się, że tak E. coli Wytworzyć dobrze rozwinięte niebiesko-czarne kolonie z zielonym metalicznym połyskiem. Tak długo jak, Enterobacter aerogenes i Klebsiella sp muszą dawać dobrze rozwinięte kolonie śluzowe niebieskawo-czarne.

Ze swojej strony, Salmonella typhimurium i Shigella flexneri, muszą rozwijać duże kolonie, bezbarwne lub o lekkim bursztynowym kolorze.

Wreszcie gatunek Pseudomonas aeruginosa rośnie jako bezbarwne kolonie o nieregularnych rozmiarach, podczas gdy bakterie Gram-dodatnie powinny być całkowicie zahamowane lub rosnące oszczędnie z bardzo małymi koloniami.

Uwagi końcowe

Czasami sterylizacja powoduje, że błękit metylenowy zmniejsza się, obserwując pomarańczowy środek. W celu utlenienia błękitu metylenowego i odzyskania fioletowego koloru, należy go delikatnie mieszać, aż do odzyskania koloru.

Również po sterylizacji może wytrącić barwnik, więc musi być dobrze wymieszany przed podaniem płytek Petriego.

Referencje

  1. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B i Velázquez O. 2009. Techniki analizy mikrobiologicznej żywności. 2nd ed. Wydział Chemii, UNAM. Meksyk.
  2. Carranza C, León R, Falcón N, Neumann A, Kromm C. Charakterystyka i dystrybucja szczepów Escherichia coli Potencjalnie patogenne izolaty brojlerów z kurczaka z ferm drobiu w Peru. Rew. weterynarz. Peru 2012 23 (2): 209-219. Dostępne pod adresem: scielo.org.
  3. Laboratories Conda S.A. Agar z eozyną i błękit metylenowy. 2010. Dostępny na: condalab.com
  4. Laboratories Britania. Levine E.M.B (Z Eozyną i Błękitem Metylenowym) 2011. Dostępny na: britanialab.com
  5. Laboratoria BD Agar BD EMB (Eozynowy Niebieski Agar Metylenowy), Zmodyfikowany. 2013. Dostępny pod adresem: bd.com
  6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnostyka mikrobiologiczna. (5 wyd.). Argentyna, redakcja Panamericana S.A..
  7. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnostyka mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Argentyna Panamericana S.A Editorial