Agar ma standardowe podłoże, przygotowanie i zastosowania



The standardowy agar konta jest stałym, nieselektywnym podłożem hodowlanym, przeznaczonym do ilościowego oznaczania tlenowego ładunku mikrobiologicznego występującego w próbkach wody pitnej, ścieków, napojów mlecznych, wśród innych produktów spożywczych. To medium jest również znane jako agar PCA, ze względu na skrót w angielskim Plate Count Agar. Został stworzony w 1953 roku przez Buchbindera, Barisa i Goldsteina.

Rachunek standardowego podłoża agarowego składa się z ekstraktu drożdżowego, tryptyny, glukozy, agaru i wody destylowanej. Ten preparat zawiera podstawowe składniki odżywcze, które pozwalają na rozwój obecnego tlenowego obciążenia mikrobiologicznego, nie wymagające.

Ponieważ podłoże nie zawiera inhibitorów, bakterie mogą rozwijać się bez żadnych ograniczeń, więc jest to idealne rozwiązanie dla ogólnej liczby kolonii. Jednak technika kwantyfikacji płytek nie wykryje wszystkich obecnych bakterii, ale tylko te, które są zdolne do wzrostu w warunkach środowiskowych, którym poddawany jest standardowy posiew agaru..

W tym sensie, technika ilościowego oznaczania płytek ma na celu określenie ogólnie ilości tlenowych bakterii typu mezofilnego, to znaczy tych, które rozwijają się w temperaturach między 25 a 40 ° C, z optymalną temperaturą wzrostu w 37 ° C.

Ta grupa bakteryjna jest bardzo ważna, ponieważ większość patogennych bakterii jest dla człowieka.

Należy zauważyć, że czasami może być interesujące określenie ilości bakterii psychrofilnych obecnych w żywności. Te bakterie to te, które rozwijają się w niskich temperaturach (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

Podobnie bakterie termofilne, które rozwijają się w zakresie od 50 ° C do 80 ° C lub więcej, mogą być ważne w niektórych rodzajach żywności, takich jak konserwy.

Kwantyfikacja mikrobiologiczna jest wyrażana w jednostkach tworzących kolonie (CFU) na gram lub mililitr próbki.

Indeks

  • 1 Fundacja
  • 2 Przygotowanie
    • 2.1 Do techniki nalewania płytek
    • 2.2 Do sadzenia powierzchni
  • 3 Użyj
    • 3.1 Technika zalewania płyty (wysiewana wg głębokości)
    • 3.2 Technika zasiana na powierzchni
  • 4 Kontrola jakości
  • 5 Ograniczenia
  • 6 referencji

Fundacja

Standardowe medium zliczające zostało zaprojektowane tak, aby umożliwić zadowalający rozwój niepotrzebnych bakterii tlenowych, ponieważ ekstrakt drożdżowy, trifina i glukoza dostarczają niezbędnych składników odżywczych dla dobrego rozwoju drobnoustrojów.

Z drugiej strony, medium ma wyraźny kolor i przezroczysty wygląd, dlatego idealnie nadaje się do wyświetlania kolonii opracowanych metodą głębokiego siewu (wlewanie w talerz).

Możliwe jest również liczenie kolonii metodą wysiewu na powierzchni szpatułką Drigalskiego.

Gdy obciążenie mikrobiologiczne jest wysokie, należy wykonać dziesiętne rozcieńczenia badanej próbki w celu policzenia CFU.

Należy zauważyć, że to medium jest zalecane przez Amerykańskie Stowarzyszenie Zdrowia Publicznego (APHA) do liczenia tlenowych mezofilów.

Przygotowanie

Odważyć 23,5 g odwodnionego podłoża i rozpuścić w jednym litrze wody destylowanej. Aby całkowicie rozpuścić mieszaninę należy często mieszać, aż się zagotuje. Kolejne kroki zależą od stosowanej techniki wysiewu.

Do techniki nalewania płytek

Rozprowadzić, dozując 12 do 15 ml do probówek. Następnie sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 ° C przez 15 minut. Pozostawić do zestalenia się pionowo w postaci bloku. Przechowywać w lodówce do czasu użycia.

Stopić wskazówkę, kiedy będzie używana. Po stopieniu trzymać go w łaźni wodnej o temperaturze 44-47 ° C podczas przygotowywania próbek.

Do sadzenia na powierzchni

Sterylizować podłoże w autoklawie w temperaturze 121 ° C, a następnie rozprowadzić 20 ml w sterylnych szalkach Petriego. Pozostawić do zestalenia, odwrócić i przechowywać w lodówce do momentu użycia.

Odpuść płyty przed użyciem. PH pożywki powinno wynosić 7,0 ± 0,2.

Użyj

Standardową liczbę agarów stosuje się w aerobowej technice liczenia mezofilów podczas analizy mikrobiologicznej wody i żywności. Niezbędne jest zliczanie mezofili tlenowych, ponieważ określa ono jakość sanitarną badanej próbki.

Zastosowanie tej techniki (przy użyciu tego medium) pozwala na makroskopową wizualizację izolowanych kolonii w celu ich ilościowego oznaczenia.

Technika nalewania płytki nazębnej (wysiewana według głębokości)

-Procedura

Technika składa się z następujących elementów:

1) Homogenizuj próbkę, aby rozprowadzić obecne bakterie.

2) Początkową zawiesinę przeprowadza się w sterylnej fiolce lub woreczku, uwzględniając stosunek 10 g lub 10 ml próbki w 90 ml rozcieńczalnika (10-1).

3) Z początkowego zawieszenia sporządza się odpowiednie rozcieńczenia dziesiętne w zależności od rodzaju próbki. Np .: (10-2, 10-3, 10-4). Rozcieńczenia sporządza się za pomocą wody peptonowej lub buforu fosforanowego.

W tym celu należy pobrać 1 ml początkowej zawiesiny i umieścić w 9 ml rozcieńczalnika, w razie potrzeby kontynuować rozcieńczanie, biorąc teraz 1 ml rozcieńczenia.-2 i tak dalej.

4) Weź 1 ml każdego rozcieńczenia i umieść w pustych sterylnych szalkach Petriego.

5) Dodać do każdej płytki 12 do 15 ml standardowego agaru zliczającego uprzednio stopionego i ustawić na 44 - 47 ° C.

6) Daj gładkie ruchy obrotowe płytek, aby równomiernie rozprowadzić próbkę na agarze i pozwolić na zestalenie.

7) Odwróć płytki i inkubuj w 37 ° C w aerobiozie przez 24 do 48 godzin.

8) Gdy skończy się czas, przejdź do zbadania płytek i policz kolonie w rozcieńczeniu, które na to pozwala. Jest on wybierany do liczenia tych płyt, które mają od 30 do 300 CFU.

Liczenie można wykonać ręcznie lub można użyć licznika kolonii.

Dozwolone wartości na ml próbki mogą się różnić w zależności od kraju, zgodnie z normami, którymi podlegają.

-Obliczanie UFC

Ogólne obliczenia są wykonywane przy użyciu następującego wzoru:

Wyraź wyniki w 1 lub 2 cyfrach, mnożąc przez odpowiednią bazę 10. Przykład: jeśli wynik wynosi 16.545, jest zaokrąglany w oparciu o trzecią cyfrę do 17.000 i będzie wyrażony w następujący sposób: 1,7 x 104. Teraz, jeśli wynik wynosił 16 436, zaokrąglono do 16 000 i wyrażono 1,6 x 104.

Technika osadzona na powierzchni

-Procedura

-Zaszczepić 0,1 ml bezpośredniej próbki, jeśli jest płynna, początkowa zawiesina 10-1 lub kolejnych rozcieńczeń 10-2, 10-3 itp., na środku standardowej płytki agarowej konta.

-Równomiernie rozłożyć próbkę szpachelką Drigalskiego lub szklanym prętem w kształcie litery L. Odstawić na 10 minut.

-Odwrócić płytki i inkubować w aerobiozie w 37 ° C przez 24 do 48 godzin.

-Kontynuuj liczenie kolonii, wybierz te płytki, które mieszczą się w zakresie od 20 do 250 CFU.

-Obliczanie UFC

Do obliczeń stosuje się współczynnik rozcieńczenia, czyli odwrotność. Liczba jest zaokrąglana do 2 cyfr znaczących (zaokrąglanie według trzeciej cyfry) i jest wyrażana w mocy podstawy 10. Na przykład, jeśli 224 CFU jest liczone w próbce bez rozcieńczania (10-1), Zgłoszono 22 x 101  UFC, ale jeśli liczba ta wynosi 225, to podaje się ją 23 x 101 UFC.

Teraz, jeśli policzysz 199 CFU w rozcieńczeniu 10-3, Zgłoszone zostanie 20 x 104 UFC, ale jeśli 153 CFU zostanie policzone w tym samym rozcieńczeniu, zostanie zgłoszone 15 x 104 UFC.

Kontrola jakości

Standardową pożywkę hodowlaną można obliczyć przy użyciu znanych certyfikowanych szczepów, takich jak: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Jeśli pożywka hodowlana jest w optymalnych warunkach, we wszystkich przypadkach oczekuje się zadowalającego wzrostu, z wyjątkiem L. fermentum które mogą mieć regularne wyniki.

Aby ocenić sterylność pożywki hodowlanej, jedną lub dwie płytki każdej przygotowanej partii (niezaszczepionej) należy inkubować w 37 ° C w aerobiszu przez 24 godziny. Pod koniec tego czasu nie należy obserwować wzrostu lub zmiany koloru podłoża..

Ograniczenia

-Nie topić agaru więcej niż raz.

-Przygotowane podłoże może trwać do 3 miesięcy, o ile jest przechowywane w lodówce i chronione przed światłem.

-To podłoże nie jest odpowiednie dla wymagających mikroorganizmów ani beztlenowców.

Referencje

  1. Krajowa Administracja Leków Żywność i Technologia Medyczna (ANMAT). Analiza mikrobiologiczna żywności, oficjalna metodologia analityczna, mikroorganizmy wskaźnikowe. 2014 Tom 3. Dostępny na stronie: anmat.gov.ar
  2. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories, S.A. Agar z licznikiem talerzy. 2009. Dostępny pod adresem: http://f-soria.es
  3. Laboratoria Conda Pronadisa. Agar do standardowych metod (PCA) zgodnie z APHA i ISO 4833. Dostępny na: condalab.com
  4. Laboratories Britania. Liczenie na płytce agarowej. 2015. Dostępny na: britanialab.com
  5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B i Velázquez O. 2009. Techniki analizy mikrobiologicznej żywności. 2nd ed. Wydział Chemii, UNAM. Meksyk Dostępne pod adresem: depa.fquim.unam