Dzielić:
Podstawa, przygotowanie i stosowanie agaru cytrynianowego
The Agar cytrynianowy Simmons Jest to podłoże stałe używane jako test biochemiczny do identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii Gram-ujemnych. Oryginalny nośnik został stworzony przez Koser w 1923 roku.
Pożywka cytrynianowa Koser składała się z bulionu zawierającego fosforan sodu, fosforan amonu, fosforan monopotasowy, siarczan magnezu i cytrynian sodu..
Jak widać, jedynym źródłem węgla w pożywce jest cytrynian, a azot jest fosforanem amonu, białka i węglowodany są pomijane jako źródło tych pierwiastków, są one powszechnie obecne w innych mediach..
Dlatego bakteria zaszczepiona tym podłożem może się rozmnażać tylko wtedy, gdy jest w stanie przyjąć węgiel cytrynianowy. Test był pozytywny, jeśli w podłożu wystąpiło zmętnienie, jednak miało to tę wadę, że mogło wystąpić niespecyficzne zmętnienie.
Ten problem został rozwiązany przez Simmonsa dodającego agar i błękit bromotymolowy do oryginalnej formuły Kosera. Chociaż zasada jest taka sama, interpretuje się ją inaczej.
Indeks
- 1 Fundacja
- 1.1 Tryb siewu
- 1.2 Interpretacja
- 2 Przygotowanie
- 3 Użyj
- 4 Uwagi końcowe
- 4.1 Inokulum
- 4.2 Nasiona
- 4.3 Intensywność koloru
- 5 referencji
Fundacja
Niektóre bakterie mają zdolność przetrwania w przypadku braku fermentacji lub produkcji kwasu mlekowego, co wymaga uzyskania energii poprzez użycie innych substratów. W tym teście jedynym źródłem oferowanego węgla jest cytrynian.
Bakterie zdolne do przeżycia w tych warunkach szybko metabolizują cytrynian poprzez alternatywę wobec tradycyjnej drogi, stosując cykl kwasu trikarboksylowego lub cykl fermentacji cytrynianu.
Katabolizm cytrynianu przez bakterie obejmuje mechanizm enzymatyczny bez interwencji koenzymu A. Enzym ten znany jest jako cytrazaza (cytrynian szczawiooctanu-liaza) lub cytrynian desmolaza. Reakcja wymaga obecności dwuwartościowego kationu, który w tym przypadku jest dostarczany przez magnez.
Reakcja wytwarza szczawiooctan i pirogronian, które następnie powodują powstawanie kwasów organicznych w środku alkalicznego pH utworzonego przez zastosowanie źródła azotu. Te kwasy organiczne są stosowane jako źródło węgla wytwarzające węglany i wodorowęglany, dodatkowo alkalizujące podłoże.
Tryb siewu
Pożywkę cytrynianową Simmonsa należy lekko zaszczepić w ogon ryb przy użyciu prostej pętli lub igły i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 35–37 ° C. Pod koniec czasu wyniki są obserwowane.
Siew odbywa się tylko na powierzchni agaru. Nie rób punkcji.
Interpretacja
Jeśli podłoże ma oryginalny kolor (zielony) i nie ma widocznego wzrostu, wynik testu jest ujemny, ale jeśli medium zmieni kolor na niebieski, oznacza to obecność produktów alkalicznych, które są wykrywane przez wskaźnik pH. W tym przypadku test jest pozytywny.
Dzieje się tak, ponieważ jeśli bakteria wykorzystuje węgiel cytrynianu, jest również zdolna do przyjmowania azotu fosforanu amonu, z którym uwalnia amoniak, alkalizując podłoże.
Z drugiej strony, jeśli obserwuje się wzrost bakterii w podłożu, ale nie ma zmiany koloru, test należy również uznać za pozytywny, ponieważ jeśli występuje wzrost, oznacza to, że bakterie były w stanie użyć cytrynianu jako źródła węgla, chociaż w tej chwili nie ma zmiany pH (czasami może to potrwać).
Jeśli istnieją wątpliwości co do interpretacji ostatecznego koloru, można go porównać z probówką z niezaszczepionym cytrynianem.
Przygotowanie
Odważyć 24,2 g odwodnionego podłoża na jeden litr wody. Wymieszaj i odstaw na około 5 minut. Zakończyć rozpuszczanie medium przez ogrzewanie przez 1 lub 2 minuty, często mieszając.
Podawać 4 ml w probówkach i autoklawować w 121 ° C przez 15 minut. Wychodząc z autoklawu, przechyl się za pomocą podpory w taki sposób, aby agar zestalił się w postaci szczytu fletu z małym knagiem lub dnem i większym skosem.
Końcowe pH pożywki cytrynianowej wynosi 6,9 (zielony). To podłoże jest bardzo wrażliwe na zmianę pH.
Przy pH 6 lub niższym medium staje się żółte. Ten kolor nie jest obserwowany w teście z bakteriami.
Przy pH 7,6 lub wyższym medium zmienia się w intensywny błękit pruski.
Użyj
Agar cytrynianowy Simmons stosuje się do identyfikacji niektórych mikroorganizmów, zwłaszcza laseczek należących do rodziny Enterobacteriaceae i innych pałeczek niefermentujących glukozy..
Uwagi końcowe
Medium cytrynianowe Simmonsa jest bardzo delikatnym testem, ponieważ można uzyskać fałszywe trafienia, jeśli zostaną popełnione pewne błędy.
Należy zachować ostrożność:
Inokulum
Nie twórz bardzo grubego lub obciążonego inokulum bakteryjnego, ponieważ może to spowodować powstanie miedzianego żółtego koloru w miejscu sadzenia, bez wpływu na resztę podłoża, ale może to prowadzić do przekonania, że istnieje wzrost. To samo nie oznacza pozytywności testu.
Podobnie grube inokulum może generować fałszywy wynik pozytywny, ponieważ wstępnie utworzone związki organiczne w ścianach komórkowych umierających bakterii mogą uwalniać wystarczającą ilość węgla i azotu, aby zmienić wskaźnik pH.
Dlatego idealnym rozwiązaniem jest posadzenie igły zamiast rękojeści platynowej, aby uniknąć pobierania nadmiaru materiału.
Zasiane
Z drugiej strony, gdy zestaw testów biochemicznych jest wykorzystywany do identyfikacji omawianego mikroorganizmu, ważne jest, aby test cytrynianowy był pierwszym szczepieniem, aby uniknąć przeciągania białek lub węglowodanów z innego podłoża.
W tej sytuacji możliwe jest uzyskanie fałszywie dodatniego wyniku, ponieważ każda z tych substancji wprowadzonych omyłkowo będzie metabolizowana i spowoduje zmianę pH.
Innym sposobem uniknięcia przeciągania się substancji jest dobre wypalenie uchwytu i pobranie nowego inokulum między jednym testem a drugim.
Należy zachować ostrożność podczas dotykania kolonii w celu wykonania inokulum, ponieważ należy unikać przeciągania części agaru z kultury, z której pochodzą bakterie, ze względu na wyjaśnione wcześniej.
W tym sensie Matsen, Sherris i Branson zalecają rozcieńczenie inokulum w roztworze fizjologicznym przed zaszczepieniem testu cytrynianowego, aby uniknąć przeniesienia innych źródeł węgla.
Intensywność koloru
Należy wziąć pod uwagę, że intensywność koloru wytwarzanego, gdy test jest pozytywny, może się różnić w zależności od domu handlowego.
Ponadto istnieją mikroorganizmy, które testują dodatnie po 24 godzinach, ale istnieją inne szczepy, które wymagają 48 godzin lub więcej, aby spowodować zmianę pH.
Referencje
- Mac Faddin J. (2003). Testy biochemiczne do identyfikacji bakterii o znaczeniu klinicznym. 3rd ed. Od redakcji Panamericana. Buenos Aires Argentyna.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostyka mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana S.A. Argentyna.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnostyka mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana S.A. Argentyna.
- Laboratoria BD BBL Simmons Citrate Agar Slants. 2015. Dostępny pod adresem: bd.com
- Laboratories Britania. Simmons Citrate Agar. 2015. Dostępny na: britanialab.com
- Valtek Diagnostic Laboratories. Simmons Citrate Agar. 2016. Dostępny pod adresem: andinamedica.com.