Fundacja testowa Voges-Proskauer, przygotowanie i zastosowania



The Test Vogesa-Proskauera jest testem biochemicznym, który służy do identyfikacji bakterii należących do rodziny Enterobacteriaceae. Szczególnie przydatne jest rozróżnienie szczepów Escherichia coli z Klebsiella i Enterobacter, między innymi.

Test przeprowadza się w płynnej pożywce hodowlanej zwanej red-metylo-Voges Proskauer, lepiej znanej pod skrótem RM / VP. Podłoże to składa się z buforowanego polipeptydu, glukozy, fosforanu dipotasowego i wody destylowanej.

Obecna pożywka RM / VP jest modyfikacją podłoża Clarka i Lubsa, które pierwotnie zawierało niższe stężenie peptonów i glukozy. W związku z tym wytworzono mniej jonów wodorowych, wymaganych do dodatniej reakcji Vogesa-Proskauera.

Test opiera się na zdolności mikroorganizmu do stosowania glukozy drogą glikolu butylenowego i tworzenia neutralnego produktu końcowego o nazwie acetoina, w obecności tlenu i zasadowego pH.

W medium RM / VP oprócz tego, że jest w stanie ujawnić test Vogesa-Proskauera, można również ujawnić test czerwieni metylowej.

Indeks

  • 1 Fundacja
    • 1.1 Podstawa testu Vogesa-Proskauera
    • 1.2 Podstawa opracowania testu i interpretacji
  • 2 Przygotowanie
    • 2.1 Średnie RM / VP
    • 2.2 Voges A Reagent
    • 2.3 Odczynnik Voges B.
  • 3 Procedura testu Vogesa-Proskauera
    • 3.1 Opracowanie testu
  • 4 Użyj
  • 5 Kontrola jakości
  • 6 referencji

Fundacja

Podstawa testu Vogesa-Proskauera

Pluripeptonas obecny w podłożu zapewnia niezbędne składniki odżywcze niezbędne do rozwoju bakterii. Ze swojej strony glukoza jest głównym związkiem. Wiele bakterii ma zdolność metabolizowania glukozy i tworzenia kwasu pirogronowego.

Kwas pirogronowy jest środkowym punktem metabolizmu glukozy i stąd każdy drobnoustrój może przyjmować różne drogi. Niektóre będą tworzyć mieszane kwasy, takie jak kwas mlekowy, kwas octowy, kwas mrówkowy i kwas bursztynowy, a inne będą tworzyć neutralne produkty, takie jak 2,3-butanodiol.

Test Vogesa-Proskauera ujawnia zdolność mikroorganizmu do tworzenia acetylometylokarbinolu (acetoiny), produktu pośredniego 2,3-butanodiolu w warunkach tlenowych.

Acetoina jest zredukowana i tworzy 2,3-butanodiol, ale ta reakcja jest odwracalna, więc jeśli 2,3-butanodiol zostanie utleniony, powstaje acetoina. Dlatego tlen jest niezbędny.

Fosforan dipotasowy jest buforem, który tłumi mieszaninę przy pH 6,9 ± 0,2..

Podstawa opracowania testu i interpretacji

Aby zademonstrować reakcję, należy przeprowadzić rozwój przy użyciu dwóch odczynników (odczynników Barrit), znanych jako Voges A i Voges B.

Voges A jest 5% roztworem α-naftolu, a Voges B jest 40% preparatem wodorotlenku potasu. Jeśli wodorotlenek potasu nie jest dostępny, można go zastąpić 40% wodorotlenkiem sodu.

Α-naftol jest katalizatorem, który zwiększa intensywność koloru reakcji, co czyni test bardziej wrażliwym. Α-naftol należy zawsze dodawać najpierw, mieszając probówkę tak, aby medium wchodziło w kontakt z tlenem. W ten sposób obecna acetoina jest utleniana do diacetylu, a 2,3-butanodiol jest utleniany do acetoiny, przekazując ją do diacetylu.

W ten sposób α-naftol będzie wiązał się z diacetylem, który z kolei został połączony z jądrem guanidyny obecnym w aminokwasie arginina, ta ostatnia pochodzi z pluripeptonów.

Ze swojej strony wodorotlenek potasu lub sodu jest odpowiedzialny za absorpcję CO2 i reagować z peptonami. Ta reakcja powoduje powstanie różowo-łososiowego koloru, wyraźnie widocznego po bardzo dobrym wytrząsaniu probówki.

Aby zabarwienie nastąpiło natychmiast, należy zmieszać prawidłowe ilości diacetylu, peptonu i α-naftolu. Jeśli tak się nie stanie, pozostaw rurkę na 15 minut przed interpretacją.

Zazwyczaj test jest pozytywny po 2 do 5 minutach, gdy można zaobserwować słaby różowy kolor. Jeśli pozostaniesz w spoczynku przez 30 minut do 1 godziny, intensywność koloru będzie maksymalna (głęboka czerwień).

Negatywny wynik testu będzie widoczny, gdy bulion jest żółty. Po 1 godzinie, jeśli wynik testu jest ujemny, może powstać kolor miedzi w wyniku reakcji wodorotlenku potasu na α-naftolu.

Przygotowanie

Średnie RM / VP

Odważyć 17 g odwodnionej pożywki hodowlanej i rozpuścić w jednym litrze wody destylowanej. Odstaw na 5 minut. Ogrzewać do wrzenia, aby całkowicie się rozpuścić. Podawać 3 do 4 ml w probówkach i sterylizować w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut.

Odwodniona pożywka hodowlana jest beżowa, a przygotowana pożywka jest jasnobursztynowa.

Końcowe pH pożywki wynosi 6,9 ± 0,2.

Voges A Reagent

Odważyć 5 g α-naftolu i rozpuścić w 50 ml alkoholu etylowego (absolutnego). Następnie kontynuuj dodawanie alkoholu etylowego, aby uzupełnić do 100 ml.

Odczynnik Voges B

Odważyć 40 g wodorotlenku potasu i rozpuścić w 50 ml wody destylowanej w zlewce. Szkło należy umieścić w zimnej łaźni wodnej, aby kontrolować temperaturę, ponieważ w momencie rozpuszczania preparat gwałtownie wzrasta.

Po schłodzeniu roztworu przenosi się go do balonu miarowego i doprowadza do 100 ml wodą destylowaną.

Procedura testu Vogesa-Proskauera

Aby wykonać test Vogesa-Proskauera, bulion RM / VP zaszczepia się badanym mikroorganizmem z czystej kultury od 18 do 24 godzin.

Inokulum nie powinno być zbyt gęste. Inkubuje się w 35-37 ° C przez 24 do 48 godzin, chociaż czasami inkubacja jest konieczna przez kilka dni. Cowan i Steel uważają, że 5 dni to minimalny czas inkubacji niezbędny do wykrycia wszystkich pozytywnych gatunków Voges-Proskauer (VP) z rodziny Enterobacteriaceae.

Opracowanie testu

Oddzielić 1 ml podwielokrotność w probówce i wykonać wywoływanie w następujący sposób: umieścić 12 kropli (0,6 ml) odczynnika Voges A i 4 krople (0,2 ml) Voges B. Wymieszać w celu napowietrzenia i odstawić przez 5-10 minut przed wykonaniem. Jeśli jednak test jest nadal negatywny, odstaw go i obserwuj probówkę po 30 minutach do 1 godziny.

Wygląd różowo-czerwonego koloru wskazuje, że reakcja Vogesa-Proskauera jest pozytywna. Jeśli medium pozostaje żółte, reakcja jest negatywna.

Dodanie programistów w podanej kolejności i ilości jest niezbędne, aby uniknąć fałszywych wyników.

Użyj

Test Vogesa-Proskauera jest przydatny do odróżnienia szczepów E. coli które są VP negatywne, rodzajów Klebsiella, Enterobacter, Serratia, między innymi, które są VP pozytywne.

Kontrola jakości

Szczepy kontrolne można wykorzystać do testowania jakości przygotowanego podłoża. Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium i Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Oczekiwane wyniki to tylko pozytywne reakcje Voges-Proskauer K. pneumoniae i E. cloacae. Reszta daje negatywne reakcje.

Referencje

  1. Laboratories Britania. MR-VP Medium. 2015. Dostępny na: www.britanialab.com
  2. Microkit Laboratories M-Ident Voges Proskauer. 2014. Dostępne: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Testy biochemiczne do identyfikacji bakterii o znaczeniu klinicznym. 3rd ed. Od redakcji Panamericana. Buenos Aires Argentyna.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostyka mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana S.A. Argentyna.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnostyka mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana S.A. Argentyna.