Sekwencjonowanie DNA Maxam-Gilbert, metoda Sangera, przykłady

The Sekwencjonowanie DNA (kwas deoksyrybonukleinowy) to procedura przeprowadzana w laboratoriach biologii molekularnej, która umożliwia poznanie kolejności nukleotydów w materiale genetycznym będącym przedmiotem zainteresowania. Ponadto można również ujawnić sekwencjonowanie RNA (kwasu rybonukleinowego).

Ta technika była niezbędna dla rozwoju nauk biologicznych. Dotyczy to także innych dziedzin wiedzy - na przykład diagnostyki medycznej i badań kryminalistycznych.

Wcześniej sekwencjonowanie nici DNA uznawano za powolną i kosztowną aktywność, co pozwoliło na zidentyfikowanie tylko kilku par zasad w oligonukleotydach.

Obecnie, wraz z postępem nauki, sekwencjonowanie DNA jest rutynową operacją w wielu laboratoriach na całym świecie dzięki wkładowi prawie 50 lat badań w tej dziedzinie. Jeśli chodzi o długość łańcucha, możesz sekwencjonować do milionów par zasad w bardzo krótkim czasie.

W tym celu opracowano dziesiątki technik różniących się ceną i dokładnością. W tym artykule opiszemy zarówno techniki klasyczne, jak i nowoczesne, z których każda ma swoje zalety i wady.

Do tej pory techniki sekwencjonowania pozwalają uzyskać sekwencję kompletnych genomów, od małych prokariotów i drożdży po ludzki genom.

Indeks

• 1 Struktura DNA
• 2 Historia
• 3 Metoda Sangera
  • 3.1 Główne składniki reakcji
  • 3.2 Odczytywanie wyników
• 4 Automatyczne sekwencjonowanie
• 5 Sekwencjonowanie Maxam-Gilberta
  • 5.1 Procedura
  • 5.2 Odczyt wyników
• 6 Masywne sekwencjonowanie
  • 6.1 Pyrosekwencjonowanie
  • 6.2 Sekwencjonowanie przez syntezę
  • 6.3 Sekwencjonowanie przez ligację
  • 6.4 Sekwencjonowanie Ion Torrent
• 7 Przykłady
  • 7.1 Sekwencjonowanie ludzkiego genomu
• 8 Znaczenie i zastosowania
• 9 Odniesienia

Struktura DNA

Aby zrozumieć metody i techniki stosowane do sekwencjonowania DNA, konieczne jest poznanie pewnych kluczowych aspektów struktury i składu cząsteczki.

DNA jest biocząsteczką występującą we wszystkich organizmach żywych, od bakterii po duże zwierzęta wodne. Organelle - podobnie jak mitochondria i chloroplasty - mają wewnątrz cząsteczkową cząsteczkę DNA. Nawet w niektórych wirusach znalezionym materiałem genetycznym jest DNA.

Strukturalnie DNA jest zbiorem nukleotydów. Każdy z nich jest zintegrowany z węglowodanem, bazą azotową (A, T, C lub G) i grupą fosforanową. Celem sekwencjonowania DNA jest ujawnienie kolejności, w jakiej znajdują się cztery zasady azotowe w sekwencji.

Historia

W połowie lat 50. badacze Watson i Crick opisali strukturę DNA przy użyciu technik chrystologicznych. Jednak żaden z tych badaczy nie był w stanie znaleźć sposobu na odkrycie sekwencji.

Chociaż byli pewni poprzednicy, najważniejszym wydarzeniem było stworzenie metody Sangera w 1977 roku. Frederick Sanger, ojciec metody, był brytyjskim biochemikiem, zdobywcą dwóch nagród Nobla za ogromny wkład w nauki biologiczne.

Ta technika jest również znana w literaturze jako „zakończenie łańcucha” lub dideoksynukleotydy. Następnie opiszemy zasady tej techniki i te, które zostały opracowane w oparciu o ulepszenia i innowacje tego.

Metoda Sangera

Rozwój metody Sangera stanowił kluczowe wydarzenie w biologii molekularnej. Obejmuje podstawowe składniki procesu replikacji DNA, które normalnie zachodzą w komórce, ale przez dodanie specjalnego składnika: dideoksynukleotydów.

Główne składniki reakcji

- Polimeraza DNA: enzym polimeraza DNA jest kluczowym elementem tego procesu. Cząsteczka ta uczestniczy w replikacji nici DNA, a jej rolą jest synteza nowego łańcucha, dopasowując trifosforan deoksyrybonukleotydów do komplementarnych.

Pamiętaj, że w DNA tyminy (T) są sparowane z adeninami (A) za pomocą dwóch wiązań wodorowych, podczas gdy cytozyna (C) działa z guaniną (G) za pomocą trzech mostków.

- Nukleotydy: Sekwencjonowanie Sangera obejmuje dwa typy nukleotydów, cztery 2'-deoksynukleotydy (w skrócie dATP, dGTP, dCTP i dTTP) i cztery dideoksynukleotydy (ddATP, ddGTP, ddCTP i ddTTP).

Chociaż dideoksynukleotydy są podobne do monomerów, które normalnie są włączone do DNA, w ich strukturze brakuje grupy -OH. To uniemożliwia dodanie nowego łańcucha nukleotydowego do łańcucha.

Dlatego, gdy specjalny nukleotyd jest dodawany - w sposób całkowicie losowy - do łańcucha tworzącego się, synteza jest sparaliżowana. W ten sposób pod koniec reakcji występują łańcuchy o różnych rozmiarach, z których każdy zatrzymuje reakcję w innym punkcie.

Eksperymentalnie przygotowano cztery próby. Każdy zawiera DNA wyekstrahowany z interesującej próbki biologicznej, normalne nukleotydy i jeden z czterech typów specjalnych nukleotydów. Lub specjalne nukleotydy są oznaczone jakimś rodzajem znacznika fluorescencyjnego (patrz poniżej automatyczne sekwencjonowanie).

Czytanie wyników

Pierwszym krokiem jest oddzielenie każdego z syntezowanych łańcuchów w zależności od ich wielkości. Niektóre będą dłuższe niż inne, w zależności od tego, gdzie zostały umieszczone specjalne bazy.

Istnieją różne techniki biochemiczne, które umożliwiają oddzielenie składników mieszaniny przy użyciu rozmiaru jako właściwości dyskryminacyjnej. W metodzie Sangera różne łańcuchy są rozdzielane przez elektroforezę. W najbardziej wyrafinowanych wariantach tej techniki stosuje się elektroforezę kapilarną.

Tak więc dłuższe nici poruszają się mniej niż krótsze warianty. Następnie ten system przechodzi przez czytnik, który rozpoznaje marker zawarty w każdym dideoksynukleotydzie. W ten sposób można poznać kolejność sekwencji.

Ta technika „pierwszej generacji” jest w stanie odczytać fragmenty DNA nie większe niż 1 kilobaza. Obecnie metoda Sangera jest stosowana w kilku laboratoriach, na ogół w jej nowoczesnych wariantach. Ponadto służy do potwierdzania wyników uzyskanych przy użyciu najbardziej złożonych technik - ale mniej precyzyjnych.

Automatyczne sekwencjonowanie

Gdy konieczne jest sekwencjonowanie na dużą skalę, proces jest przyspieszany przez automatyzację. Jest to odmiana metody zakończenia łańcucha Sanger, w której startery są oznaczone produktami fluorescencyjnymi w celu ich odróżnienia.

Następnie produkt reakcji jest prowadzony w elektroforezie - wszystko w jednym pasie. Gdy każdy fragment opuszcza końcową część żelu, jest szybko identyfikowany przez etykietę fluorescencyjną, z błędem, który otacza 1%.

Najbardziej wyrafinowane systemy mają system do 96 rurek kapilarnych obsługiwanych przez komputer połączony z robotem. Oznacza to, że 96 próbek DNA można ocenić jednocześnie. Zatem proces obejmujący elektroforezę i analizę wyników jest całkowicie zautomatyzowany.

W ciągu jednego dnia systemy te mogą sekwencjonować do 550 000 baz. Podczas procesu praca człowieka jest niepotrzebna, uruchomienie metody zajmuje tylko około 15 minut.

Sekwencjonowanie autorstwa Maxama-Gilberta

W tym samym czasie, gdy Sanger opublikował swoją pracę, dwóm badaczom imieniem Allan Maxan i Walter Gilbert udało się opracować inną metodę uzyskiwania sekwencji DNA. Metoda zyskała wówczas popularność, ale później została zastąpiona przez ulepszenie metody Sangera.

W przeciwieństwie do metody Sangera, sekwencjonowanie Maxana i Gilberta (lub sekwencjonowanie chemiczne, jak również wiadomo) nie obejmuje reakcji hybrydyzacji. Metodologia polega na oznaczeniu reaktywnymi środkami na jednym końcu, a następnie na procesie oczyszczania.

Jednym z negatywnych aspektów tej techniki jest jej ogromna złożoność i stosowanie substancji chemicznych, które są niebezpieczne dla użytkownika. Rozpad chemiczny jest wywoływany przez zastosowanie DMS, kwasu mrówkowego, hydrazyny i hydrazyny z solami.

Procedura

Protokół rozpoczyna się od oznakowania na końcu 5 'nici znacznikiem luminoforu 32, a następnie następuje chemiczna modyfikacja zasady azotowej i jest ona rozdzielana. W końcu następuje rozszczepienie obszaru abasicznego.

Najpierw sekwencjonowany łańcuch jest skracany do mniejszych segmentów. Ten etap przeprowadza się za pomocą enzymów restrykcyjnych, które powodują wyjątkowe ekstrema.

Następnie reakcję prowadzi się za pomocą fosfatazy alkalicznej, której celem jest wyeliminowanie grupy fosforanowej. Zatem kinazę polinukleotydową można zastosować do przeprowadzenia znakowania.

Łańcuch jest denaturowany (dwie nici otwarte). Następnie przystępujemy do stosowania chemikaliów. Te reakcje rozszczepiania są wykonywane w kontrolowany sposób i jakie rodzaje wiązań są łamane przez każdy zastosowany środek chemiczny.

Czytanie wyników

Podobnie jak w metodzie Sangera, odczyt wyników obejmuje rozdzielenie wielkości łańcuchów uzyskanych w systemie elektroforezy. Systemy złożone z poliakryloamidu pozwalają uzyskać bardzo odpowiednią rozdzielczość do odczytu żelu.

Ogromne sekwencjonowanie

Ogromne sekwencjonowanie obejmuje szereg nowatorskich metod, w skrócie NGS, z angielskiego ”Sekwencjonowanie następnej generacji ”.

Metody skatalogowane jako NGS wymagają wcześniejszego etapu amplifikacji DNA (nie działają z pojedynczą cząsteczką). Ponadto używane platformy różnią się znacznie. Zasady najpopularniejszych metod zostaną opisane poniżej:

Pirosekwencjonowanie

Polega ona na monitorowaniu uwalniania pirofosforanu, który pojawia się za każdym razem, gdy do nici DNA dodaje się nowy nukleotyd. Układ enzymatyczny jest sprzężony, tak że emisja światła (która jest wykrywana przez kamerę) zachodzi za każdym razem, gdy włączany jest nowy nukleotyd.

Proces rozpoczyna się od oddzielnej inkubacji każdej bazy azotowej w celu sprawdzenia, czy występuje emisja światła. Pyrosekwencjonowanie może wykonywać odczyt długich nici, ale znaleziony współczynnik błędu jest wysoki.

Sekwencjonowanie przez syntezę

Obejmuje to włączenie znakowanych nukleotydów. Te składniki fluorescencyjne dodaje się, przemywa i odnotowuje wbudowany nukleotyd. Następnie eliminuje się znakowanie nukleotydów i kontynuuje syntezę nici. W następnym etapie zostanie również dołączony znakowany nukleotyd i wspomniane etapy zostaną powtórzone.

Jedna wada tej techniki występuje, gdy znaczniki fluorescencyjne nie są całkowicie wyeliminowane. Emisje te powodują błędy w tle, powodując znaczące błędy.

Sekwencjonowanie przez ligację

Ta technika różni się od innych, ponieważ nie wykorzystuje polimerazy DNA. Zamiast tego kluczowym enzymem w tej metodologii jest ligaza. Tutaj są używane fragmenty DNA znakowane fluorescencyjnie, związane przez enzym i wykrywane.

Największym problemem związanym z tą techniką jest bardzo krótki odcinek, który jest zdolny do przetwarzania.

Sekwencjonowanie jonów Torrent

Ta technika opiera się na pomiarze jonu H⁺ który jest uwalniany za każdym razem, gdy włączany jest nowy nukleotyd. Zasada jest dość podobna do pirosekwencjonowania, ale znacznie tańsza.

Przykłady

Sekwencjonowanie ludzkiego genomu

Sekwencjonowanie genomu człowieka było jednym z najbardziej obiecujących wyzwań w biologii, a także jedną z najbardziej uznanych rywalizacji w historii nauki. W rzeczywistości dla naukowców zaangażowanych w projekt sekwencjonowanie genomu stało się konkurencją.

W 1990 roku rozpoczął projekt zwany „ludzkim genomem”, prowadzony przez słynnego naukowca, zdobywcę nagrody Nobla, Jamesa Watsona. Po roku, w 1991 roku, Venter podejmuje wyzwanie „pokonania” Watsona i sekwencjonowania genomu przed nim. Jednak w roku 1992 Watson przeszedł na emeryturę, a polecenie zostało odebrane przez innego badacza.

W 1995 roku Venter ogłosił sukces w całkowitym sekwencjonowaniu genomu bakteryjnego metodą losowego sekwencjonowania. Podobnie, przeciwny zespół ogłosił rok później sekwencjonowanie genomu drożdży.

W roku 2000 wyścig został zakończony. Obie firmy opublikowały wstępne wyniki pełnego genomu w dwóch najbardziej prestiżowych czasopismach naukowych: Natura i Nauka.

Jednak naukowcy kontynuowali prace nad ulepszeniem propozycji, aw 2006 r. Sekwencje zostały uzupełnione o pewne ludzkie chromosomy.

Znaczenie i zastosowania

Znajomość kolejności nukleotydów cząsteczki tak ważna jak DNA jest cenna dla biologów i pokrewnych specjalistów. Ten łańcuch polinukleotydów zawiera wszystkie informacje niezbędne do rozwoju i utrzymania wszystkich form życia.

Z tych powodów znajomość tej sekwencji jest niezbędna dla badań biologicznych. Zasadniczo sekwencjonowanie pozwala nam zmierzyć jedną z najważniejszych właściwości układów biologicznych i ustalić różnice między nimi.

Sekwencjonowanie jest szeroko stosowane przez taksonomów i systemistów, ponieważ niektóre sekwencje DNA pozwalają na ustalenie kryteriów pozwalających stwierdzić, czy dwa organizmy należą do tego samego gatunku, czy nie, a także są w stanie zaproponować hipotezy dotyczące związków filogenetycznych między nimi..

Ponadto sekwencjonowanie DNA ma zastosowanie w dziedzinie medycyny i diagnostyki. Na przykład istnieją niedrogie i dostępne systemy, które dzięki sekwencjonowaniu pozwalają nam ocenić tendencję do rozwoju pewnych chorób (takich jak rak) przy użyciu tak zwanych polimorfizmów prostych nukleotydów (SNP)..

Badania typu kryminalistycznego i kryminalistycznego zostały również wzbogacone o techniki sekwencjonowania i mogą być wykorzystane jako wiarygodne dowody udziału określonej osoby w przestępstwie.

Referencje

1. Heather, J. M., & Chain, B. (2016). Sekwencja sekwencjonerów: historia sekwencjonowania DNA. Genomika, 107(1), 1-8.
2. Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K. i Mardis, E.R. (2013). Następna generacja rewolucji sekwencyjnej i jej wpływ na genomikę. Komórka, 155(1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Rywalizacja naukowa. Od Galileo do projektu ludzkiego genomu. Paraninfo Editorial.
4. Sanger, F., Nicklen, S., i Coulson, A. R. (1977). Sekwencjonowanie DNA za pomocą inhibitorów kończących łańcuchy. Materiały z krajowej akademii nauk, 74(12), 5463-5467.
5. Schuster, S. C. (2007). Sekwencjonowanie nowej generacji przekształca dzisiejszą biologię. Metody przyrodnicze, 5(1), 16.
6. Xu, J. (wyd.). (2014). Sekwencjonowanie nowej generacji. Caister Academic Press.