Mikromacierze DNA w tym, co się składa, procedura i zastosowania



A Mikromacierz DNA, Zwany także chipem DNA lub mikromacierzą DNA, składa się z szeregu fragmentów DNA zakotwiczonych do fizycznego nośnika materiału zmiennego, plastiku lub szkła. Każdy fragment DNA reprezentuje sekwencję komplementarną do określonego genu.

Głównym celem mikromacierzy jest badanie porównawcze ekspresji pewnych interesujących genów. Na przykład powszechne jest, że technika ta jest stosowana do dwóch próbek - jednej w warunkach zdrowych i jednej patologicznej - w celu określenia, które geny są wyrażane i które nie znajdują się w próbce, która przedstawia warunek. Wspomniana próbka może być komórką lub tkanką.

Ogólnie ekspresję genów można wykryć i określić ilościowo dzięki zastosowaniu cząsteczek fluorescencyjnych. Manipulacja chipami jest w większości przypadków przeprowadzana przez robota, a duża liczba genów może być analizowana jednocześnie.

Ta innowacyjna technologia jest przydatna w wielu dziedzinach, od diagnostyki medycznej po różne badania biologii molekularnej w dziedzinie proteomiki i genomiki.

Indeks

  • 1 Z czego się składa??
    • 1.1 Typy mikromacierzy
  • 2 Procedura
    • 2.1 Izolacja RNA
    • 2.2 Produkcja i znakowanie cDNA
    • 2.3 Hybrydyzacja
    • 2.4 Odczyt systemu
  • 3 aplikacje
    • 3.1 Rak
    • 3.2 Inne choroby
  • 4 odniesienia

Z czego to się składa??

Mikromacierze DNA (kwas deoksyrybonukleinowy) to zestaw specyficznych segmentów DNA przyłączonych do stałej matrycy. Sekwencje te są komplementarne do genów, które chcą być badane i może występować do 10 000 genów na cm2.

Te cechy pozwalają na systematyczne i masowe badanie ekspresji genów organizmu.

Informacje potrzebne komórce do działania są kodowane w jednostkach zwanych „genami”. Niektóre geny zawierają instrukcje tworzenia podstawowych cząsteczek biologicznych zwanych białkami.

Gen ulega ekspresji, jeśli jego DNA jest transkrybowany do pośredniej cząsteczki informacyjnego RNA, a ekspresja genu może się różnić w zależności od poziomu transkrypcji tego segmentu DNA. W niektórych przypadkach zmiana ekspresji może wskazywać na choroby.

Zasada hybrydyzacji umożliwia działanie mikromacierzy. DNA jest cząsteczką złożoną z czterech typów nukleotydów: adeniny, tyminy, guaniny i cytozyny.

Aby utworzyć podwójną strukturę helikalną, adenina jest zgrupowana z tyminą i cytozyną z guaniną. Zatem dwa komplementarne łańcuchy mogą być połączone wiązaniami wodorowymi.

Rodzaje mikromacierzy

Jeśli chodzi o strukturę mikromacierzy, istnieją dwie odmiany: spersonalizowane związki komplementarnego DNA lub oligonukleotydów i komercyjne mikromacierze o wysokiej gęstości wytwarzane przez firmy komercyjne, takie jak Affymetrix GeneChip.

Pierwszy typ mikromacierzy umożliwia analizę RNA z dwóch różnych próbek na pojedynczym chipie, podczas gdy druga zmienność jest typu komercyjnego i ma dużą liczbę genów (na przykład GeneChip Affymetrix ma około 12 000 ludzkich genów) umożliwiając analizę pojedyncza próbka.

Procedura

Izolacja RNA

Pierwszym krokiem do przeprowadzenia eksperymentu z wykorzystaniem technologii mikromacierzy jest izolacja i oczyszczanie cząsteczek RNA (może to być informacyjny RNA lub inne rodzaje RNA).

Jeśli chcesz porównać dwie próbki (między innymi zdrowe i chore, kontrola a leczenie), należy wykonać izolację cząsteczki w obu tkankach.

Produkcja i znakowanie cDNA

Następnie RNA poddaje się procesowi odwrotnej transkrypcji w obecności znakowanych nukleotydów, a zatem uzyskuje się komplementarny DNA lub cDNA..

Znacznik może być fluorescencyjny i musi być różnicowalny między dwiema analizowanymi tkankami. Związki fluorescencyjne Cy3 i Cy5 są tradycyjnie stosowane, ponieważ emitują fluorescencję przy różnych długościach fal. W przypadku Cy3 jest to kolor zbliżony do czerwonego, a Cy5 odpowiada widmowi pomiędzy pomarańczowym i żółtym.

Hybrydyzacja

CDNA miesza się i prowadzi się inkubację w mikromacierzy DNA, aby umożliwić hybrydyzację (tj. Wiązanie) cDNA z obu próbek z częścią DNA unieruchomioną na stałej powierzchni mikromacierzy..

Wyższy procent hybrydyzacji z sondą w mikromacierzy jest interpretowany jako większa ekspresja tkankowa odpowiedniego mRNA.

Odczyt systemu

Kwantyfikacja ekspresji odbywa się poprzez włączenie systemu czytnika, który przypisuje kod koloru do ilości fluorescencji emitowanej przez każdy cDNA. Na przykład, jeśli czerwony jest używany do oznaczenia stanu patologicznego i hybrydyzuje w większej proporcji, czerwony składnik będzie dominujący.

Dzięki temu systemowi można poznać nadekspresję lub represję każdego genu analizowanego w obu wybranych warunkach. Innymi słowy, możesz znać transkryptom próbek ocenianych w eksperymencie.

Aplikacje

Obecnie mikromacierze są uważane za bardzo skuteczne narzędzia w dziedzinie medycyny. Ta nowa technologia pozwala na diagnozowanie chorób i lepsze zrozumienie sposobu modyfikowania ekspresji genów w różnych warunkach medycznych.

Ponadto umożliwia porównanie tkanki kontrolnej i tkanki leczonej określonym lekiem w celu zbadania skutków ewentualnego leczenia.

Aby to zrobić, stan normalny i stan chorobowy są porównywane przed i po podaniu leku. Podczas badania wpływu leku na genom in vivo masz lepszy przegląd mechanizmu jego działania. Ponadto można zrozumieć, dlaczego niektóre konkretne leki prowadzą do niepożądanych skutków ubocznych.

Rak

Rak jest na szczycie listy chorób badanych za pomocą mikromacierzy DNA. Metosologia ta została wykorzystana do klasyfikacji i prognozowania choroby, szczególnie w przypadku białaczki.

Dziedzina badania tego warunku obejmuje kompresję i charakteryzację podstaw molekularnych komórek nowotworowych w celu znalezienia wzorców ekspresji genów, które powodują awarie w regulacji cyklu komórkowego i w procesach śmierci komórki (lub apoptozy).

Inne choroby

Dzięki zastosowaniu mikromacierzy udało nam się wyjaśnić profile zróżnicowanej ekspresji genów w stanach chorobowych alergii, pierwotnych niedoborach odporności, chorobach autoimmunologicznych (takich jak reumatoidalne zapalenie stawów) i chorobach zakaźnych..

Referencje

  1. Bednar, M. (2000). Technologia i zastosowanie mikromacierzy DNA. Monitor nauk medycznych, 6(4), MT796-MT800.
  2. Kurella, M., Hsiao, L., Yoshida, T., Randall, J. D., Chow, G., Sarang, S., ... i Gullans, S. R. (2001). Analiza mikromacierzy DNA złożonych procesów biologicznych. Dziennik Amerykańskiego Towarzystwa Nefrologii, 12(5), 1072-1078.
  3. Nguyen, D.V., Bulak Arpat, A., Wang, N. i Carroll, R.J. (2002). Eksperymenty mikromacierzy DNA: aspekty biologiczne i technologiczne. Biometria, 58(4), 701-717.
  4. Plous, C. V. (2007). Mikromacierze DNA i ich zastosowania w badaniach biomedycznych. Magazyn CENIC. Nauki biologiczne, 38(2), 132-135.
  5. Wiltgen, M. i Tilz, G. P. (2007). Analiza mikromacierzy DNA: zasady i wpływ kliniczny. Hematologia, 12(4), 271-287.