Fundacja bulionu mocznikowego, przygotowanie i zastosowania

The bulion mocznikowy jest płynną pożywką hodowlaną, stosowaną do wykazania obecności enzymu ureazy w niektórych mikroorganizmach. Ureaza jest enzymem mikrobiologicznym wytwarzanym konstytutywnie, to znaczy jest syntetyzowany niezależnie od tego, czy substrat, na którym działa, jest obecny czy nie.

Funkcja ureazy jest związana z rozkładem związków organicznych. Nie wszystkie mikroorganizmy są zdolne do syntezy tego enzymu, dlatego jego oznaczenie w laboratorium pozwala na identyfikację pewnych szczepów bakteryjnych, a nawet rozróżnienie między gatunkami tego samego rodzaju..

Istnieją dwa rodzaje testu mocznikowego: Stuart i Christensen. Różnią się składem i wrażliwością. Pierwszy jest wyjątkowy, aby pokazać dużą ilość ureazy produkowanej przez gatunki z rodzaju Proteus.

Drugi jest bardziej czuły i może wykryć niewielkie ilości ureazy wytwarzane późno przez inne rodzaje bakterii, takie jak Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter i Mycobacterium.

Bulion mocznikowy Stuart składa się z mocznika, chlorku sodu, fosforanu dipotasu, fosforanu monopotasowego, ekstraktu drożdżowego, czerwieni fenolowej i wody destylowanej.

Podczas gdy bulion Christensen lub agar mocznik składa się z peptonów, chlorku sodu, fosforanu monopotasowego, glukozy, mocznika, czerwieni fenolowej, wody destylowanej i agaru. Ten ostatni tylko wtedy, gdy jest stałym medium.

Indeks

• 1 Fundacja
  • 1.1 Bulion mocznikowy Stuart
  • 1.2 Bulion Christensen lub agarowy mocznik
  • 1.3 Interpretacja obu mediów (Stuart i Christensen)
• 2 Przygotowanie
  • 2.1 Bulion mocznikowy Stuart
  • 2.2 Bulion Christensena lub mocznik agarowy
• 3 zastosowania
• 4 Siew test mocznika
• 5 Kontrola jakości
• 6 referencji

Fundacja

Enzym ureaza hydrolizuje mocznik, tworząc dwutlenek węgla, wodę i dwie cząsteczki amoniaku. Związki te reagują tworząc końcowy produkt zwany węglanem amonu.

Bulion mocznikowy Stuart

Bulion mocznikowy Stuart jest bardziej buforowany o pH 6,8. Dlatego mikroorganizm musi być zdolny do tworzenia dużych ilości amonu, aby zmienić kolor na czerwony na fenol. PH musi wzrosnąć powyżej 8.

Dlatego bulion mocznikowy Stuart jest selektywny dla gatunków Proteus, dając pozytywne wyniki w ciągu 24 do 48 godzin inkubacji i nie jest skuteczny dla bakterii, które wytwarzają małe ilości ureazy lub które powoli hydrolizują mocznik.

Dzieje się tak dlatego, że gatunki Proteus są w stanie używać mocznika jako źródła azotu. Natomiast inne bakterie wytwarzające ureazę potrzebują dodatkowego źródła.

Jednak Pérez i in. (2002) ustalili, że bulion mocznikowy Stuart był tak skuteczny jak agar mocznikowy z Christensen, w celu określenia ureazy w szczepach drożdży z rodzaju Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon i Saccharomyces..

Autorzy badania twierdzą, że osiągnęli 100% zbieżność z obiema mediami (Stuart i Christensen) przez inkubację przez 24 i 48 godzin; z zastrzeżeniem, że pozytywnie przyjęli szczepy, które zdołały przekształcić media w silny kolor różowo-fuksyjny.

To wyjaśnienie jest konieczne, ponieważ Lodder (1970) potwierdził, że prawie wszystkie drożdże potrafią umieścić skos z agaru mocznikowego Christensena na bladym różu. Dzieje się tak dlatego, że mogą one hydrolizować mocznik w minimalnych ilościach i do tworzenia amin przez oksydacyjną dekarboksylację aminokwasów na powierzchni. Nie należy tego interpretować jako pozytywnego.

Rosół lub agar mocznikowy od Christensen

Bulion mocznikowy Christensen lub agar jest mniej buforowany, co pozwala wykryć niewielkie ilości amonu. Ponadto podłoże to jest wzbogacone w peptony i glukozę. Związki te powodują rozwój innych mikroorganizmów wytwarzających ureazę, które nie rosną w bulionie Stuarta.

Podobnie, test mocznika Christensena oferuje szybsze wyniki, szczególnie dla Proteusa, będąc w stanie dać silnie pozytywne w zaledwie 30 minut jako minimalny czas i do 6 godzin jako maksymalny czas.

Pozostałym mikroorganizmom produkującym ureazę udaje się lekko zmienić kolor podłoża po 6 godzinach, a silnie po 24, 48, 72 lub więcej godzinach, a nawet niektóre szczepy mogą dawać słabe reakcje po 5 lub 6 dniach.

Interpretacja obu mediów (Stuart i Christensen)

Medium jest pierwotnie żółto-pomarańczowe, a reakcja dodatnia zmieni kolor średniej do różowo-fuksji. Intensywność koloru jest wprost proporcjonalna do ilości wytworzonego amonu.

Ujemna reakcja pozostawi medium o oryginalnym kolorze, z wyjątkiem drożdży, które mogą dawać jasnoróżowy z agarem mocznika Christensen.

Przygotowanie

Bulion mocznikowy Stuart

Zważ niezbędne gramy zgodnie ze wskazaniami domu handlowego. Rozpuścić w najlepiej sterylnej wodzie destylowanej. Nie używaj ciepła do rozpuszczania, ponieważ mocznik jest wrażliwy na ciepło.

Metodę filtracji membranowej stosuje się do sterylizacji. W tym celu stosuje się filtr Millipore o porach o średnicy 0,45 μ. Nie używaj autoklawu. Po przefiltrowaniu roztworu jest on rozprowadzany w sterylnych probówkach. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy przenieść je między 1,5 ml jako minimalną ilość do 3 ml jako maksymalną ilość na probówkę..

Przed użyciem przechowywać w lodówce i temperować.

Jeśli metoda filtracji nie jest dostępna, nośnik powinien zostać użyty natychmiast, aby uzyskać wiarygodne wyniki.

Inny sposób przygotowania bulionu mocznika Stuarta jest następujący:

Niektóre domy handlowe sprzedają połowę bazy do testu mocznika, nie licząc mocznika.

Ilość wskazana przez dom handlowy jest ważona. Rozpuszcza się w wodzie destylowanej i sterylizuje w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut. Pozwól mu trochę odpocząć, a gdy medium jest ciepłe, dodaj 100 ml roztworu mocznika przygotowanego w 20% i sterylizuj przez filtrację.

Jest on rozprowadzany w sterylnych probówkach, jak opisano wcześniej.

Rosół lub agar mocznikowy od Christensen

-Przygotowanie roztworu mocznika

Odważyć 29 gramów odwodnionego mocznika i rozpuścić w 100 ml wody destylowanej. Użyj metody filtracji do sterylizacji. Nie autoklawuj.

-Agar na bazie mocznika

Rozpuścić 24 g odwodnionego agaru podstawowego w 950 ml wody destylowanej. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 ° C przez 15 minut. Odstawić, aż osiągnie temperaturę 50 ° C i aseptycznie dodać uprzednio przygotowany mocznik.

Wlać 4 do 5 ml do sterylnych probówek i przechylać aż do zestalenia. Powinien istnieć długi szczyt fletu.

To podłoże można również przygotować w postaci płynnej.

Używa

Test mocznika jest niezwykle skuteczny w odróżnianiu rodzaju Proteus od innych rodzajów rodziny Enterobacteriaceae, biorąc pod uwagę szybką reakcję zapewnianą przez Proteus.

Jeśli stosuje się kompozycję Christensen, test pomaga odróżnić gatunki tego samego rodzaju. Na przykład, S. haemolyticus i S. warneri sna Staphylococcus koagulazo-ujemne i betahemolityczne, ale różnią się w tym S. haemolyticus to jest ujemny mocznik i S. warneri to jest dodatni mocznik.

Z drugiej strony McNulty z powodzeniem stosował 2% bulion mocznikowy Christensen do badania obecności Helicobacter pylori w próbkach biopsji pobranych z błony śluzowej żołądka (region antralny).

Obecność H. pylori dowodzi tego pozytywny test mocznika. Czas obserwacji wyników jest wprost proporcjonalny do ilości obecnych mikroorganizmów.

Jak widać, jest to prosta metoda diagnozy Helicobacter pylori w biopsjach żołądka.

Wreszcie test ten jest również przydatny do odróżnienia gatunków rodzajów Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus i Mycobacteria.

Siew test mocznika

Dwie metody wymagają silnego inokulum mikrobiologicznego, aby zoptymalizować wyniki. Kolonie bakteryjne są korzystnie pobierane z agaru z krwią i drożdży agarowych Sabourauda, ​​z pewnymi wyjątkami. Inokulum emulguje się w ciekłym ośrodku.

W przypadku bulionu mocznikowego Stuart inkubowano w 37 ° C przez 24 do 48 godzin, wiedząc, że szuka się tylko szczepów rodzaju Proteus, gdy szczepem jest bakteria. W przypadku drożdży może być inkubowany w 37 ° C lub w temperaturze pokojowej przez 24–48 godzin inkubacji.

W przypadku bulionu mocznikowego Christensen inkubować w 37 ° C przez 24 godziny. Jeśli wynik testu jest negatywny, można go inkubować do 6 dni. Jeśli wynik testu jest pozytywny przed 6 godzinami, oznacza to, że jest to szczep rodzaju Proteus.

W przypadku agaru mocznikowego Christensen skos agarowy jest silnie zaszczepiony, bez nakłuwania. Bulion jest inkubowany i interpretowany w ten sam sposób.

Kontrola jakości

Szczepy kontrolne można wykorzystać do testowania podłoża, takiego jak Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 i Salmonella typhimurium.  Pierwsze dwa muszą dawać pozytywne wyniki, a dwa ostatnie negatywne.

Referencje

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Zastosowanie bulionu mocznikowego Stuart do testu ureazy, jako test w diagnostyce drożdży. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Dostępne pod adresem: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Testy biochemiczne do identyfikacji bakterii o znaczeniu klinicznym. 3rd ed. Od redakcji Panamericana. Buenos Aires Argentyna.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostyka mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana S.A. Argentyna.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnostyka mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana S.A. Argentyna.
5. Laboratories Britania. Christensen Medio (baza agarowa mocznika) 2015. Dostępna na: britanialab.com