Podłoże MIO, przygotowanie i zastosowanie



The połowa MIO jest testem biochemicznym, który służy do identyfikacji gatunków bakterii należących do rodziny Enterobacteriaceae. Jest dość pożywny i składa się z glukozy, ekstraktu drożdżowego, peptonu, tryptyny, chlorowodorku L-ornityny, purpury bromokrezolowej i agaru.

Znaczenie jego akronimu (MIO) opisuje każdy z parametrów, które można zaobserwować w tym medium; ruchliwość, indol i ornityna. Ruchliwość to zdolność mikroorganizmu do poruszania się w obecności wici. Aby ta właściwość była obserwowana, konsystencja podłoża musi być półstała, aby preparat miał mniejszą ilość agaru..

Produkcja indolu świadczy o obecności enzymu tryptofanazy, który działa na aminokwas tryptofan, będąc koniecznym zastosowaniem odczynnika ujawniającego, aby produkcja indolu była widoczna.

Wreszcie ornityna określa, czy bakteria jest zdolna do dekarboksylacji aminokwasu, to znaczy, czy ma enzym dekarboksylaza orinityny.

Indeks

  • 1 Fundacja
    • 1.1 Pepton, ekstrakt drożdżowy i tryptyna
    • 1.2 Ruchliwość
    • 1.3 Glukoza
    • 1.4 L-ornityna
    • 1.5 Wskaźnik pH
  • 2 Technika siewu i rozwoju
  • 3 Przygotowanie
    • 3.1 Medium MIO
    • 3.2 Odczynnik Kovacsa (twórca testu indolowego)
  • 4 Użyj
  • 5 Kontrola jakości
  • 6 referencji

Fundacja

Pepton, ekstrakt drożdżowy i tryptyna

Elementy te przyczyniają się do siły odżywczej tego medium. Służą jako źródło składników odżywczych i niezbędnych aminokwasów do rozwoju bakterii.

Ponadto tryptyna jest źródłem tryptofanu, aby udowodnić obecność enzymu tryptofanazy, który rozkłada tryptofan przez redukcyjną deaminację uwalniającą indol, kwas pirogronowy, amoniak i energię.

Indol jest bezbarwny, więc jego obecność ujawnia się przez dodanie pięciu kropli odczynnika Ehrlicha lub Kovacsa, oba z p-dimetyloaminobenzaldehydem.

Grupa aldehydowa tego związku reaguje z indolem, tworząc na powierzchni agaru czerwony pierścień w kształcie fuksji.

Wszelkie ślady koloru należy uznać za pozytywne dowody. Test należy odczytać natychmiast, ponieważ po pewnym czasie kolor ulega degradacji.

Z drugiej strony test ten powinien zostać ujawniony po zarejestrowaniu wyników ruchliwości i dekarboksylacji ornityny..

Interpretacja

Pozytywny test: tworzenie się czerwonego pierścienia fuksji podczas dodawania kropli odczynnika Kovacsa.

Test negatywny: nie ma formacji pierścienia.

Ruchliwość

Zdolność bakterii do poruszania się zostanie udowodniona, jeśli zaobserwuje się mętne medium lub jeśli istnieje gęsta linia wzrostu, która rozszerza się wokół początkowej inokulacji.

Negatywny test motoryki zostanie potwierdzony przez obserwację cienkiej linii wzrostu, a dookoła będzie bez wzrostu.

Ważne jest, aby ruchliwość była odczytywana przed ujawnieniem indolu, ponieważ dodanie odczynnika powoduje obłok całego medium.

W ruchomych, ale wolno rosnących bakteriach trudno jest wykazać ich ruchliwość za pomocą tego podłoża. W takim przypadku zaleca się stosowanie innych testów lub metod, takich jak medium ruchliwości lub metoda kropli.

Glukoza

Glukoza jest zdolnym do fermentacji węglowodanem, który oprócz dostarczania energii zakwasza medium, co jest warunkiem koniecznym dla dekarboksylacji aminokwasu ornityny..

Fermentacja glukozy powinna zawsze następować w oparciu o zasadę, że wszystkie bakterie należące do rodziny Enterobacteriaceae fermentują glukozę.

L-Ornityna

Jeśli bakteria produkuje enzym dekarboksylazę ornityny, może działać po zakwaszeniu podłoża przez fermentację glukozy.

Enzym dekarboksylaza ornityny działa na grupę karboksylową aminokwasu wytwarzając aminę zwaną putresyną, która ponownie alkalizuje podłoże.

Ten test należy odczytać po 24 godzinach inkubacji, ponieważ jeśli spróbujesz odczytać, możesz źle zinterpretować test z fałszywie negatywnym.

Należy pamiętać, że pierwszą reakcją, która występuje, jest fermentacja glukozy, tak że podłoże staje się żółte w początkowej fazie (najpierw 10 do 12 godzin). Jeśli następnie nastąpi dekarboksylacja ornityny, medium zmieni kolor na fioletowy.

Ważne jest, aby zinterpretować test dekarboksylacji ornityny przed ujawnieniem indolu, ponieważ dodanie odczynnika Kovacsa zmienia kolor podłoża.

Interpretacja

Test negatywny: średnio żółty lub z żółtym tłem.

Pozytywny test: całkowicie fioletowy.

Wskaźnik PH

W tym przypadku stosuje się purpurę bromokrezolową; osoba odpowiedzialna za ujawnienie zmiany pH w środku. Po zakwaszeniu wskaźnik zmienia kolor na żółty, a gdy alkalizowany zmienia kolor na fioletowy.

Technika nasion i rozwoju

Aby posadzić podłoże MIO, stosuje się prostą pętlę lub igłę, a wraz z nią pobiera się część badanej kolonii..

Głębokie przebicie wykonuje się w medium MIO w linii prostej. Nie zaleca się wykonywania podwójnych nakłuć, ponieważ może to dać fałszywy obraz ruchliwości, jeśli przebicia nie zostaną wykonane w tym samym miejscu.

Inkubować przez 24–48 godzin w 37 ° C w aerobiozie. Obserwuj wyniki w następującej kolejności: ruchliwość, dekarboksylacja ornityny i na koniec ujawnij indol.

Zaleca się aseptyczne pobranie 2 ml pożywki, przeniesienie do sterylnej probówki i wykonanie tam testu indolowego, aby w razie ujemnego wyniku reszta oryginalnej probówki mogła być inkubowana przez 24 godziny, aby ponownie odsłonić indol.

Rozwój indolu przeprowadza się w następujący sposób: 3 do 5 kropli odczynnika Kovacsa dodaje się do pożywki MIO i energicznie miesza. Obserwuje się, jeśli pojawi się czerwony pierścień fuksji.

Przygotowanie

Połowa MIO

Odważ 31 g podłoża MIO i rozpuść w jednym litrze wody destylowanej.

Ogrzewać, aż mieszanina wrze przez minutę, często mieszając, aż agar całkowicie się rozpuści. Rozprowadzić 4 ml podłoża w probówkach 13/100 z bawełnianą pokrywką.

Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 ° C przez 15 minut. Wyjąć z autoklawu i odstawić prosto w stojaku w taki sposób, aby powstał półstały blok.

Przechowywać w lodówce 2-8 ° C Pozwól się uspokoić przed posadzeniem szczepu bakteryjnego.

Barwa odwodnionego podłoża jest beżowa, a medium przygotowanego lekko purpurowego opalizującego.

Końcowe pH przygotowanego podłoża wynosi 6,5 ± 0,2

Medium staje się żółte z kwaśnym pH i jest fioletowe przy pH alkalicznym.

Odczynnik Kovacsa (twórca testu indolowego)

Ten odczynnik jest przygotowany w następujący sposób:

Mierzy się 150 ml alkoholu amylowego, izoamylowego lub butylowego (dowolny z trzech). W nim rozpuszcza się 10 g p-dimetyloaminobenzaldehydu. Następnie powoli dodaje się 50 ml stężonego kwasu chlorowodorowego.

Przygotowany odczynnik jest bezbarwny lub jasnożółty. Powinien być przechowywany w bursztynowej butelce i przechowywany w lodówce. Ciemnobrązowy kolor pokazuje jego pogorszenie.

Również odczynnik Kovacsa można zastąpić odczynnikiem Ehrlicha. Ta ostatnia, będąc bardziej wrażliwa, jest preferowana do ujawnienia indolu w bakteriach, które wytwarzają go w minimalnych ilościach, jak w niektórych Gram-ujemnych niefermentujących pałeczkach i niektórych beztlenowcach.

Użyj

To podłoże jest testem uzupełniającym zestaw testów biochemicznych do identyfikacji bakterii należących do rodziny Enterobacteriaceae.

Dane dekarboksylacji ornityny służą do różnicowania Shigella sonnei, to daje pozytywne Shigella boydii, Shigella flexneri i S. dysenterieae, które dają negatywy.

Rozróżnia również rodzaj Klebsiella, który daje negatywny rodzaj Enterobacter, gdzie większość jego gatunków jest pozytywna.

Kontrola jakości

Za każdym razem, gdy przygotowywana jest partia medium MIO, można przeprowadzić test kontrolny. W tym celu znane lub certyfikowane szczepy są używane do obserwacji zachowania medium.

Szczepy, które można zastosować, to Escherichia coli, Morganella morganii, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes i Proteus mirabilis.

Oczekiwane wyniki są E. coli i M. morganii. Dan M: +, I: + i O: +.

Klebsiella pneumoniae podaje wszystkie negatywne (M: -, I: -, O :-). Proteus mirabilis i Enterobacter aerogenes dan M: + I: - i O: +.

Referencje

  1. Mac Faddin J. (2003). Testy biochemiczne do identyfikacji bakterii o znaczeniu klinicznym. 3rd ed. Od redakcji Panamericana. Buenos Aires Argentyna.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnostyka mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana S.A. Argentyna.
  3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnostyka mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana S.A. Argentyna.
  4. Laboratories Britania. MIO Medio 2015. Dostępny na: britanialab.com
  5. Laboratoria BD BBL Motility Indole Ornithine (MIO) Medium. 2007. Dostępny pod adresem: bd.com
  6. Valtek Laboratories Średni M.I.O. Motility, Indole, Ornithine. 2010. Dostępny na: andinamedica.com