Charakterystyka i przygotowanie rozmazu bakteryjnego



The rozmaz bakteryjny jest przedłużeniem w postaci cienkiej warstwy zawiesiny mikroorganizmów bakteryjnych, która jest przeprowadzana na przezroczystej szklanej płytce lub szkiełkach, w celu obserwacji pod mikroskopem optycznym.

Rozszerzenie w postaci filmu jest przeprowadzane w celu jak największego oddzielenia mikroorganizmów, ponieważ jeśli są pogrupowane, obserwacja nie jest jasna.

W badaniach kultur bakteryjnych stosuje się techniki przygotowania wymazu, utrwalania i zabarwienia w celu ich lepszej analizy. Ze względu na mały rozmiar mikroorganizmów, do obserwacji konieczny jest mikroskop optyczny.

Mikroskopy optyczne są niezbędnym narzędziem do obserwacji rozmazów. Wykorzystują soczewki optyczne i światło, pozwalając na wizualizację próbek o dużym powiększeniu.

Ogólnie, żywe komórki nie mają struktur, które są przeważnie zabarwione, widziane przez mikroskop optyczny, są bezbarwnymi, przezroczystymi próbkami i wykazują bardzo mały kontrast wewnętrzny i ich otoczenie.

Obserwacja za pomocą prostego mikroskopu pola świetlnego, bez użycia technik barwienia pomocniczego, jest bardzo ograniczona i jest stosowana tylko w niektórych przypadkach, jak w obserwacji ruchu mikroorganizmów.

Aby optymalnie obserwować mikroorganizmy, należy osiągnąć równowagę między kontrastem a rozdzielczością. Szczegóły komórek nie mogą być obserwowane pod mikroskopem, nawet w wysokiej rozdzielczości; użycie barwników jest wymagane przez techniki barwienia, które zapewniają kontrast dla obserwacji.

Indeks

  • 1 Charakterystyka dobrej jakości rozmazu bakteryjnego
    • 1.1 Doskonały kontrast
    • 1.2 Dobra poprawka
    • 1.3 Dobre barwienie
  • 2 Przygotowanie
    • 2.1 A. Frotis
    • 2.2 B. Mocowanie
    • 2,3 C. Proste barwienie
    • 2.4 D. Ostateczne zachowanie wymazu
  • 3 referencje

Charakterystyka dobrej jakości rozmazu bakteryjnego

Doskonały kontrast

Aby uzyskać doskonały kontrast, nazywa się wyrafinowane mikroskopy mikroskop kontrastu fazowego, interferencja różnicowa i mikroskop pola ciemnego. Ten typ mikroskopu służy do obserwowania między innymi struktur bakteryjnych, takich jak osłony i włókna.

Barwienie jest prostą techniką zwiększającą kontrast uzyskiwany za pomocą mikroskopu z jasnym polem. W tej technice można stosować różne barwniki, które zauważalnie poprawiają obserwację pod mikroskopem.

Plamy powstają bezpośrednio na rozmazach lub przedłużeniach zawiesin drobnoustrojów na szkiełkach, uprzednio wysuszonych i utrwalonych.

Dobra poprawka

Fiksacja jest techniką używaną do zachowania struktur komórkowych; powoduje inaktywację mikroorganizmów i przyleganie do szkła szkiełka. Istnieją różne zabiegi utrwalania: utrwalanie cieplne i utrwalanie chemiczne.

Mocowanie ciepła

Jest to metoda najczęściej stosowana w obserwacji rozmazu bakteryjnego. Technika polega na przepuszczeniu bakteryjnej zawiesiny rozmazu przez płomień zapalniczki. Ta technika jest w stanie zachować zewnętrzną morfologię bakterii, ale niszczy ich wewnętrzne struktury.

Fiksacja chemiczna

Fiksacja chemiczna wykorzystuje środki konserwujące, takie jak formaldehyd lub formaldehyd, etanol i kwas octowy, między innymi. Zaletą stosowania chemicznych środków utrwalających jest to, że zachowane są wewnętrzne struktury komórkowe mikroorganizmów.

Dobre barwienie

Najbardziej powszechne procedury barwienia uprzednio wysuszonego i utrwalonego rozmazu to barwienie dodatnie lub proste, barwienie różnicowe i barwienie negatywne. Istnieją również specjalne techniki barwienia określonych struktur komórkowych (kapsułki, zarodniki, wici).

Pozytywne barwienie lub proste barwienie

Barwienie dodatnie lub proste jest najczęściej stosowaną techniką barwienia plam. Używa barwników, które mają zdolność wiązania się z pewnymi strukturami drobnoustrojów, umożliwiając ich obserwację pod mikroskopem.

Barwniki te mają grupy chromoforowe (część barwna) w swojej strukturze chemicznej, z naprzemiennymi wiązaniami podwójnymi i wiązaniami prostymi (koniugacja). Te wiązania mogą z kolei ustanawiać wiązania jonowe lub kowalencyjne z niektórymi strukturami komórkowymi.

Barwniki stosowane w barwieniu dodatnim lub prostym są głównie pochodnymi chemicznymi anilina (kolorowe sole organiczne).

Z drugiej strony wśród barwników możemy znaleźć niektóre o podstawowym pH, a inne o kwaśnym pH.

Podstawowe barwniki

W podstawowych barwnikach grupa chromoforowa ma dodatni ładunek elektryczny. Ogromna większość mikroorganizmów prokariotycznych ma neutralne wewnętrzne pH, a ich powierzchnia komórkowa jest naładowana ujemnie. Dzięki tej elektrostatycznej interakcji chromofor wiąże się z komórką i barwi ją.

Przykładami podstawowych barwników są między innymi błękit metylenowy, fioletowy kryształ, zieleń malachitowa, zasadowa fuscyna, safranina.

Barwniki kwasowe

W barwnikach kwasowych grupa chromoforowa ma ujemny ładunek elektryczny. Są one stosowane do barwienia białek dodatnio naładowanymi grupami aminowymi. Przykładami barwników kwasowych są fuscyna kwasowa, róż bengalski, czerwień kongo i eozyna.

Barwienie różnicowe

Technika barwienia różnicowego polega na zastosowaniu dwóch barwników o różnym kolorze lub intensywności, aby odróżnić różne mikroorganizmy pod mikroskopem. Barwienie metodą Grama i barwienie opornością na kwasy alkoholowe są najczęściej stosowanymi barwnikami różnicowymi w bakteriologii.

Barwienie metodą Grama stosuje się jako wstępny test w celu poznania kształtu, wielkości, grupowania komórek, oprócz rodzaju ściany komórkowej. W teście barwienia metodą Grama bakterie ze ścianą komórkową są klasyfikowane jako bakterie Gram-dodatnie i bakterie Gram-ujemne.

Negatywne barwienie

W tej technice stosuje się barwniki chemiczne, które nie przenikają do wnętrza komórki, ale czynią to medium, w którym mikroorganizmy pojawiają się jako czarne tło.

W technice negatywnego barwienia rozmaz wytwarza się kroplą zawiesiny chińskiego tuszu lub nigrozyny, która po wyschnięciu w temperaturze pokojowej tworzy błonę nieprzezroczystą dla przechodzenia światła. W ten sposób mikroorganizmy są obserwowane jako jasne formy na ciemnym tle.

Przygotowanie

A. Rozmaz

1.- Umyć szkiełka bardzo dobrze, wysuszyć chłonnym papierem i oznakować je. Etykieta musi zawierać treść przygotowania, datę i nazwisko osoby, która je przetworzyła.

2.- Zapal zapalniczkę i sterylizuj pętlę inokulacyjną w płomieniu, aż zacznie się robić gorąco.

3.- Niech rączka ostygnie.

4.- Weź probówkę z kulturą bakteryjną, zdejmij zatyczkę i szybko przepuść usta rury w pobliżu płomienia zapalniczki (płomień).

5. Wprowadzić pętlę inokulacyjną do probówki zawierającej kulturę bakteryjną i pobrać próbkę.

6.- Jeśli kultura znajduje się w płynnej pożywce, umieść próbkę pobraną z uchwytem pośrodku szkiełka i rozprowadź ostrożnie w kole o średnicy około 2 cm.

7.- Ponownie sterylizuj pętlę inokulacji.

8.- Pozwól osuszyć rozmaz w powietrzu.

9.- Powtórz kroki od 3 do 8 trzy razy.

10.- Jeśli kultura znajduje się w podłożu stałym, kropla wody destylowanej powinna być wcześniej umieszczona na szkiełku. Wykonuje się to w celu wymieszania małej próbki kultury pobranej z uchwytem do zaszczepienia, zgodnie ze wskazówkami z etapów 2 do 5 (warunki aseptyki).

11.- Przedłuż rozcieńczoną próbkę kroplą wody na szkiełku i powtórz trzy razy.

B. Fixation

1.- Dodaj do suchych rozmazów - wyprodukowanych z kultur w płynnej pożywce - dwie krople metanolu lub absolutnego etanolu.

2.- Pozwól osuszyć się w powietrzu z dala od zapalniczki.

3.- Jeśli rozmaz pochodzi z kultury na podłożu stałym, suchy rozmaz jest utrwalany ciepłem, przepuszczając go 2 do 3 razy szybko przez najgorętszy obszar płomienia zapalniczki.

4.- Dotknij dolnej części rozmazu grzbietową częścią lewej ręki (dla praworęcznych, w przeciwnym razie użyj prawej ręki) i sprawdź, czy jest zimno.

C. Proste barwienie

1.- Dodaj 2 krople wybranego barwnika do wymazu i pozwól mu działać przez czas wymagany przez określone protokoły każdego barwnika (zwykle od 1 do 5 minut).

2.- Niektóre barwniki wymagają użycia ciepła do ich aktywacji, w którym to przypadku konieczne jest bardzo ostrożne podgrzewanie szkiełka w płomieniu zapalniczki (manipuluj nim pęsetą i unikaj wrzenia). Przegrzanie rozmazu może zniszczyć komórki, które chcesz obserwować.

3.- Usuń nadmiar barwnika, myjąc wodą destylowaną z piksetu. Usuń wodę myjącą, delikatnie stukając w suwak na jej krawędzi, przechylony na stole roboczym.

4.- Pozwól na suszenie powietrza.

5.- W zależności od rodzaju obserwacji na tym etapie stosuje się szkiełko nakrywkowe. Nakładka chroni i konserwuje rozmaz. Jeśli obserwacja jest wykonywana przez zanurzenie w oleju na tym etapie, nie stosuje się szkiełka nakrywkowego, ale rozmaz nie może być zachowany.

D. Ostateczne zachowanie wymazu

1.- Zanurz rozmaz kolejno w każdym z roztworów wskazanych poniżej przez minimum 5 minut. Celem tych „kąpieli” jest pozostawienie rozmazu całkowicie odwodnionego. Każdy odczynnik należy opróżnić przed wprowadzeniem rozmazu w następnej kąpieli.

Kolejność kąpieli odwadniających jest następująca:

  1. Etanol 70%
  2. 95% etanolu
  3. Czysty aceton
  4. Wymieszać aceton-ksylol 1: 1
  5. Xilol

Następnie pozwól na wyschnięcie powietrza.

2. Zamontuj szkiełko nakrywkowe, najlepiej 22 × 22 mm, używając balsamu kanadyjskiego lub innych środków do montażu.

Referencje

  1. Briggs, G. (1965). Czynniki przyczynowe w laboratoryjnych wypadkach i infekcjach mikrobiologicznych. Laboratoria biologiczne US Army. Fort Detrick.
  2. Cappucino, J.G. i Welch, C.T. (2017). Microbiology: A Laboratory Manual. Pearson.
  3. Holt, J.G. Edytor (1977). Krótszy Podręcznik Bakteriologii Determinatywnej Bergeya. 8th Baltimore: The Williams and Wilkins Co.
  4. Johnson, T.R. i sprawa; C.L. (2018). Eksperymenty laboratoryjne w mikrobiologii. Pearson.
  5. Tille, P. (2017). Mikrobiologia diagnostyczna. 14th St. Louis, USA: Elsiever, Inc.