Funkcje enzymów ograniczających, mechanizm działania, rodzaje i przykłady



The enzymy restrykcyjne są endonukleazami używanymi przez niektóre archeony i bakterie do hamowania lub „ograniczania” rozprzestrzeniania się w nich wirusów. Są one szczególnie powszechne u bakterii i stanowią część ich systemu obronnego przeciwko obcemu DNA znanemu jako system restrykcji / modyfikacji.

Enzymy te katalizują cięcie dwuniciowego DNA w określonych miejscach, w sposób powtarzalny i bez użycia dodatkowej energii. Większość wymaga obecności kofaktorów, takich jak magnez lub inne dwuwartościowe kationy, chociaż niektóre wymagają również ATP lub S-adenozylometioniny.

Endonukleazy restrykcyjne odkryli w 1978 r. Daniel Nathans, Arber Werner i Hamilton Smith, którzy otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny za ich odkrycie. Jego nazwa zwykle pochodzi od organizmu, w którym są obserwowane po raz pierwszy.

Takie enzymy są szeroko stosowane w rozwoju metod klonowania DNA i innych strategii biologii molekularnej i inżynierii genetycznej. Charakterystyka rozpoznawania określonych sekwencji i zdolność do cięcia sekwencji w pobliżu miejsc rozpoznawania czynią je potężnymi narzędziami w eksperymentach genetycznych.

Fragmenty generowane przez enzymy restrykcyjne, które działały na konkretną cząsteczkę DNA, można wykorzystać do odtworzenia „mapy” oryginalnej cząsteczki, wykorzystując informacje o miejscach, w których enzym przecina DNA.

Niektóre enzymy restrykcyjne mogą mieć to samo miejsce rozpoznawania w DNA, ale niekoniecznie przecinają je w ten sam sposób. Istnieją zatem enzymy, które powodują tępe końce i enzymy, które przecinają się, pozostawiając spójne końce, które mają różne zastosowania w biologii molekularnej.

Obecnie istnieją setki różnych dostępnych w handlu enzymów restrykcyjnych oferowanych przez różne domy handlowe; Enzymy te działają jak „niestandardowe” nożyczki molekularne do różnych celów.

Indeks

  • 1 Funkcje
  • 2 Mechanizm działania
  • 3 typy
    • 3.1 Enzymy restrykcyjne typu I
    • 3.2 Enzymy restrykcyjne typu II
    • 3.3 Enzymy restrykcyjne typu III
    • 3.4 Enzymy restrykcyjne typu IV
    • 3.5 Enzymy restrykcyjne typu V
  • 4 Przykłady
  • 5 referencji

Funkcje

Enzymy restrykcyjne pełnią przeciwną funkcję polimeraz, ponieważ hydrolizują lub rozrywają wiązanie estrowe w wiązaniu fosfodiestrowym między sąsiednimi nukleotydami w łańcuchu nukleotydowym.

W biologii molekularnej i inżynierii genetycznej są szeroko stosowane narzędzia do konstruowania wektorów ekspresji i klonowania, a także do identyfikacji określonych sekwencji. Są one również przydatne do budowy rekombinowanych genomów i mają wielki potencjał biotechnologiczny.

Ostatnie postępy w terapii genowej wykorzystują obecnie enzymy restrykcyjne do wprowadzania niektórych genów do wektorów, które są nośnikami transportu takich genów do żywych komórek, i które prawdopodobnie mają zdolność do wprowadzania się do genomu komórki w celu wykonania trwałe zmiany.

Mechanizm działania

Enzymy restrykcyjne mogą katalizować cięcie dwuniciowego DNA, chociaż niektóre są w stanie rozpoznać jednoniciowe sekwencje DNA, a nawet RNA. Cięcie następuje po rozpoznaniu sekwencji.

Mechanizm działania polega na hydrolizie wiązania fosfodiestrowego między grupą fosforanową i dezoksyrybozą w szkielecie każdej nici DNA. Wiele enzymów jest w stanie ciąć w tym samym miejscu, które rozpoznają, podczas gdy inne wycinają od 5 do 9 par zasad przed lub po nim..

Zwykle te enzymy tną na końcu 5 'grupy fosforanowej, dając początek fragmentom DNA o końcu fosforylowym 5' i końcu hydroksylowym końca 3 '.

Ponieważ białka nie wchodzą w bezpośredni kontakt z miejscem rozpoznawanym w DNA, muszą być kolejno przemieszczane, aż dotrą do konkretnego miejsca, być może za pomocą „ślizgowych” mechanizmów na nici DNA..

Podczas cięcia enzymatycznego wiązanie fosfodiestrowe każdej z nici DNA jest umieszczone w jednym z miejsc aktywnych enzymów restrykcyjnych. Gdy enzym opuszcza miejsce rozpoznawania i cięcia, robi to poprzez niespecyficzne przejściowe skojarzenia.

Typy

Obecnie znanych jest pięć rodzajów enzymów restrykcyjnych. Poniżej krótki opis każdego z nich:

Enzymy restrykcyjne typu I

Enzymy te są dużymi białkami pentamerycznymi z trzema podjednostkami, ograniczeniem, metylacją i innymi do rozpoznawania sekwencji w DNA. Te endonukleazy są wielofunkcyjnymi białkami zdolnymi do katalizowania reakcji restrykcyjnych i modyfikacji, mają aktywność ATPazy, a także topoizomerazę DNA.

Enzymy tego typu były pierwszymi endonukleazami do odkrycia, zostały oczyszczone po raz pierwszy w latach 60. i od tego czasu były badane z wielką głębią.

Enzymy typu I nie są powszechnie stosowane jako narzędzie biotechnologiczne, ponieważ miejsce cięcia może znajdować się w zmiennej odległości do 1000 par zasad od miejsca rozpoznawania, co czyni je niewiarygodnymi pod względem powtarzalności eksperymentalnej.

Enzymy restrykcyjne typu II

Są to enzymy złożone z homodimerów lub tetramerów, które wycinają DNA w określonych miejscach o długości od 4 do 8 pz. Te miejsca cięcia są zazwyczaj palindromiczne, to znaczy rozpoznają sekwencje odczytywane w ten sam sposób w obu kierunkach.

Wiele enzymów restrykcyjnych typu II w bakteriach tnie DNA, gdy rozpoznają swój obcy charakter, ponieważ nie posiadają typowych modyfikacji, które powinny mieć własne DNA..

Są to najprostsze enzymy restrykcyjne, ponieważ nie wymagają żadnego kofaktora innego niż magnez (Mg +) do rozpoznawania i cięcia sekwencji DNA.

Dokładność enzymów restrykcyjnych typu II w rozpoznawaniu i wycinaniu prostych sekwencji w DNA w precyzyjnych pozycjach czyni je jednymi z najczęściej używanych i niezbędnych w większości gałęzi biologii molekularnej.

W grupie enzymów restrykcyjnych typu II znajduje się wiele podklas sklasyfikowanych według pewnych właściwości, które są unikalne dla każdego z nich. Klasyfikacja tych enzymów odbywa się poprzez dodanie liter alfabetu, od A do Z po nazwie enzymu.

Niektóre z podklas najbardziej znanych ze swojej użyteczności to:

Podklasa IIA

Są dimerami różnych podjednostek. Rozpoznają sekwencje asymetryczne i są wykorzystywane jako idealne prekursory do wytwarzania enzymów tnących.

Podklasa IIB

Składają się z jednego więcej dimerów i przecinają DNA po obu stronach sekwencji rozpoznawania. Obcinają obie nici DNA w zakresie par zasad poza miejscem rozpoznawania.

Podklasa IIC

Enzymy tego typu są polipeptydami z funkcjami podziału i modyfikacji nici DNA. Enzymy te przecinają obie nici asymetrycznie.

Podklasa IIE

Enzymy tej podklasy są najczęściej używane w inżynierii genetycznej. Mają miejsce katalityczne i na ogół wymagają efektora allosterycznego. Enzymy te muszą oddziaływać z dwiema kopiami ich sekwencji rozpoznawania, aby uzyskać wydajne cięcie. W tej podklasie znajdują się enzymy EcoRII i EcoRI.

Enzymy restrykcyjne typu III

Endonukleazy restrykcyjne typu III składają się tylko z dwóch podjednostek, jedna jest odpowiedzialna za rozpoznawanie i modyfikację DNA, podczas gdy druga odpowiada za cięcie sekwencji.

Enzymy te wymagają do działania dwóch kofaktorów: ATP i magnezu. Enzymy restrykcyjne tego typu posiadają dwa asymetryczne miejsca rozpoznawania, translokują DNA w sposób zależny od ATP i przecinają go między 20 a 30 pz przylegając do miejsca rozpoznawania..

Enzymy restrykcyjne typu IV

Enzymy typu IV są łatwe do zidentyfikowania, ponieważ wycinają DNA za pomocą znaczników metylacji, składają się z kilku różnych podjednostek, które są odpowiedzialne za rozpoznawanie i cięcie sekwencji DNA. Enzymy te wykorzystują jako kofaktory GTP i dwuwartościowy magnez.

Specyficzne miejsca cięcia obejmują łańcuchy nukleotydowe z resztami metylowanej lub hydroksymetylowanej cytozyny w jednej lub obu niciach kwasów nukleinowych.

Enzymy restrykcyjne typu V

Ta klasyfikacja grupuje enzymy typu CRISPER-Cas, które identyfikują i wycinają określone sekwencje DNA z inwazyjnych organizmów. Enzymy Cas używają nici CRISPER syntetyzowanego przewodnika RNA do rozpoznawania i atakowania organizmów inwazyjnych.

Enzymy sklasyfikowane jako typ V są polipeptydami uporządkowanymi przez enzymy typu I, II i II. Potrafią wycinać fragmenty DNA prawie każdego organizmu i mieć duży zakres długości. Ich elastyczność i łatwość użycia sprawiają, że enzymy te są obecnie jednym z najczęściej stosowanych narzędzi w inżynierii genetycznej oraz enzymów typu II.

Przykłady

Enzymy restrykcyjne zastosowano do wykrywania polimorfizmów DNA, zwłaszcza w badaniach genetyki populacji i badań ewolucyjnych z użyciem mitochondrialnego DNA, w celu uzyskania informacji o szybkości podstawień nukleotydów..

Obecnie wektory stosowane do transformacji bakterii o różnych celach mają miejsca wieloklonowe, w których znajdują się miejsca rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych..

Wśród tych enzymów najbardziej popularne są EcoRI, II, III, IV i V, uzyskane i opisane po raz pierwszy E. coli; HindIII, od H. influenzae i BamHI B. amyloliquefaciens.

Referencje

  1. Bickle, T. A. i Kruger, D. H. (1993). Biologia ograniczenia DNA. Opinie mikrobiologiczne, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A. i Horvath, P. (2007). CRISPR zapewnia nabytą odporność na wirusy u prokariotów. Nauka, 315(Marzec), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Perspektywa molekularna: endonukleazy restrykcyjne. Podstawy medycyny nowotworowej, 20, 190-191.
  4. Halford, S. E. (2001). Przeskakiwanie, skakanie i zapętlanie przez enzymy restrykcyjne. Transakcje społeczeństwa biochemicznego, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Utrzymanie tożsamości gatunków i kontrola specjacji bakterii: nowa funkcja dla systemów restrykcyjnych / modyfikacji? Gene, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E. i Kilpatrick, S. (2018). Geny Lewina XII (12 ed.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... She, Q. (2015). Wykorzystanie systemów CRISPR-Cas typu I i III do edycji genomu. Badania kwasów nukleinowych, 1-12.
  8. Loenen, W. A.M., Dryden, D.T. F., Raleigh, E.A. i Wilson, G.G. (2013). Enzymy restrykcyjne typu I i ich rodziny. Badania kwasów nukleinowych, 1-25.
  9.  Nathans, D. i Smith, H. O. (1975). Endonukleazy restrykcyjne w analizie i restrukturyzacji cząsteczek DNA. Annu. Rev. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M. i Tajima, F. (1981). Polimorfizm DNA wykrywalny przez endonukleazy restrykcyjne. Genetyka, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. i Wende, W. (2005). Endonukleazy restrykcyjne typu II Cellular and Molecular Life Sciences: struktura i mechanizm. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Jak enzymy restrykcyjne stały się koniami roboczymi biologii molekularnej. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R. J. i Murray, K. (1976). Endonukleazy restrykcyjne. Krytyczne recenzje w biochemii, (Listopad), 123-164.
  14.  Stoddard, B. L. (2005). Struktura i funkcja endonukleazy naprowadzającej. Kwartalne recenzje biofizyki, 1-47.
  15.  Tock, M. R. i Dryden, D. T. F. (2005). Biologia ograniczeń i ograniczeń. Aktualna opinia w mikrobiologii, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G. G. i Murray, N. E. (1991). Systemy ograniczeń i modyfikacji. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z., i Mou, K. (2016). Spostrzeżenia genomiczne na temat zjadliwości Campylobacter jejuni i genetyki populacji. Infekować Dis. Przeł. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Struktura i mechanizm wielofunkcyjnych endonukleaz restrykcyjnych. Annu. Rev. Biochem., 50, 285-315.